本研究由来自伊朗多所研究机构的学者合作完成，主要作者包括Fatemeh Sadat Shariati（通讯作者，邮箱fshareati@yahoo.com）和Behrokh Farahmand（通讯作者，邮箱b_farahmand@pasteur.ac.ir）。研究团队来自Tarbiat Modares University材料工程系、Pasteur Institute of Iran纳米生物技术系、流感研究实验室以及伊朗国家特殊人才发展组织下属的Farzanegan高中。研究成果发表于2023年的《AMB Express》期刊，文章标题为《Synthesis of Ni2+-functionalized polydopamine magnetic beads for facilitated purification of histidine-tagged proteins》，DOI号为10.1186/s13568-023-01613-z。
学术背景
该研究属于生物技术与纳米材料交叉领域，聚焦重组蛋白纯化技术的创新。在制药工业中，重组蛋白的便捷纯化是下游生产流程的关键瓶颈。传统固定化金属亲和色谱（IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography）技术存在步骤繁琐、耗时长等缺陷。尽管六组氨酸标签（His-tag）因其分子量小、低免疫原性等优势成为最常用的蛋白纯化标签，但现有镍柱纯化方法仍面临效率与成本问题。近年来，磁性纳米材料因其高比表面积和磁分离特性显示出替代传统树脂的潜力，但现有磁性材料常需复杂修饰步骤。本研究创新性地利用聚多巴胺纳米颗粒（PDA-NPs, Polydopamine Nanoparticles）的双离子螯合特性，开发了一种新型磁性纯化系统。
研究流程
1. 材料合成与表征
- PDA-NPs制备：在pH 8.5的Tris缓冲液中氧化聚合多巴胺盐酸盐（62.105 mg/10 mL），500 rpm搅拌8小时后离心纯化，透析冻干获得基础纳米颗粒。
- 双离子螯合：将PDA-NPs（1 mg/mL）与20 mg Fe³⁺固定量混合，再梯度添加Ni²⁺（2-7 mg/mL），通过ICP-OES（电感耦合等离子体发射光谱）测定螯合效率，确定最佳Ni²⁺:PDA质量比为1.4:1。
- 表征技术：
- 形貌分析：SEM（扫描电镜）显示颗粒呈均匀球形，直径120-140 nm；DLS（动态光散射）测得流体动力学直径200-220 nm。
- 磁学性能：VSM（振动样品磁强计）测得饱和磁化强度35.42 emu/g，证实其磁分离可行性。
- 晶体结构：XRD（X射线衍射）检测到Fe₃O₄、Fe₂O₃和NiFe₂O₄的特征峰，证实离子成功螯合。
2. 蛋白纯化验证
- 模型蛋白：选用EGFP（增强型绿色荧光蛋白，26 kDa）和HSP40（热休克蛋白，40 kDa）作为His-tag重组蛋白代表。
- 纯化流程：
- 结合阶段：将细胞裂解液（总蛋白2 mg/mL）与PDA/Fe³⁺/Ni²⁺磁珠（2-15 mg/mL）在PBS中孵育15分钟。
- 洗涤阶段：10 mM咪唑缓冲液去除非特异性结合。
- 洗脱阶段：300 mM咪唑缓冲液释放目标蛋白。
- 对照实验：同步使用商业Ni-NTA柱进行纯化对比。
3. 性能评估
- 纯度检测：SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western blot验证目标蛋白条带。
- 定量分析：荧光分光光度法测定EGFP浓度（激发/发射波长485/528 nm），磁珠纯化得率138.83 μg/mL，优于商业柱（108.28 μg/mL）。
- 稳定性测试：ICP-OES监测10天内离子泄漏率，Ni²⁺和Fe³⁺释放量分别%和1.7%。
- 重复使用性：HSP40纯化实验显示磁珠可重复使用5次且效率保持90%以上。
主要结果
- 材料特性：SEM与DLS的尺寸差异反映PDA-NPs在溶液中的适度聚集行为。ICP-OES证实Ni²⁺最佳吸附量为1.4 mg/mg PDA，此时螯合效率达峰值。
- 纯化效能：Western blot显示磁珠纯化的EGFP在26 kDa处条带亮度高于商业柱。荧光定量表明10 mg/mL磁珠浓度可实现最优性价比。
- 稳定性证据：XRD谱图中30.1°(220)、35.7°(311)等特征峰证实磁性晶体结构稳定，与VSM数据相互印证。
结论与价值
该研究开创性地利用PDA-NPs直接螯合Fe³⁺/Ni²⁺的特性，开发出”一步法”磁性纯化系统，其核心优势体现在： - 科学价值：揭示了PDA表面邻苯二酚/吲哚基团与金属离子的直接配位机制，为新型功能材料设计提供理论依据。 - 应用价值：相较传统IMAC技术，将纯化步骤从5-6步缩减至3步，时间缩短50%以上，且设备成本降低（无需层析系统）。 - 工业潜力：磁珠可重复使用且载量稳定，每毫克PDA可吸附3.7 mg Fe³⁺，适合大规模生产。
研究亮点
- 方法创新：首次实现PDA-NPs双离子同步螯合，避免了传统磁珠所需的SiO₂等中间涂层。
- 性能突破：纯化得率较商业柱提高28%，且背景蛋白污染更低（SDS-PAGE杂带更少）。
- 跨学科融合：结合纳米材料合成（材料科学）与蛋白纯化（生物技术），开辟了”纳米纯化”新方向。
其他价值
研究者特别指出，该磁珠系统对低浓度样本（如临床标本）具有独特优势，其磁响应特性可高效富集痕量目标蛋白。未来可拓展至抗体纯化、诊断试剂开发等领域。研究数据已通过Origin Pro 2018和ImageJ软件严格处理，原始数据可向通讯作者申请获取。