《Journal of Bioscience and Bioengineering》1999年发表的自主复制质粒构建研究学术报告
作者及机构
本研究由日本能源公司（Japan Energy Co.）制药与生物技术实验室的Akihiro Hara、Mitsuyoshi Ueda等团队，与京都大学（Kyoto University）工程研究科合成化学与生物化学实验室的Atsuo Tanaka教授团队合作完成，发表于《Journal of Bioscience and Bioengineering》第87卷第6期（1999年6月，页码717-720）。
学术背景
研究领域：本研究属于微生物遗传工程领域，聚焦于热带假丝酵母（*Candida tropicalis*）的遗传转化系统开发。
研究动机：热带假丝酵母是一种可利用正构烷烃（n-alkane）作为碳源的二倍体酵母，在工业上用于生产二羧酸（如十三碳二酸，brassilic acid），但其生产菌株易发生回复突变，导致稳定性不足。传统化学诱变方法难以进一步优化菌株，因此需建立高效的遗传操作工具。
科学问题：热带假丝酵母缺乏自主复制质粒（autonomously replicating plasmid）系统，限制了其分子生物学研究及工业应用。
研究目标：从热带假丝酵母基因组中克隆自主复制序列（ARS），构建可在该酵母和大肠杆菌（*E. coli*）中复制的穿梭载体（shuttle vector），并建立基于ARS的转化系统。
研究流程与实验方法
1. ura3突变体与标记基因获取
- 宿主准备：通过乙基甲烷磺酸（ethylmethane sulfonate, EMS）诱变热带假丝酵母1098菌株，筛选尿嘧啶营养缺陷型（ura3）突变体（1098e13），其回复突变频率低至1.2×10⁻⁸。
- ura3基因克隆：设计引物从热带假丝酵母基因组中PCR扩增ura3基因（编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，ODCase），测序确认其与*Candida maltosa*的ura3相似性达98.5%。
ARS序列克隆与验证
穿梭载体构建与转化验证
主要结果与逻辑关联
1. ura3系统有效性：ura3突变体1098e13的低回复率（1.2×10⁻⁸）确保了转化筛选的可靠性，为后续ARS筛选提供稳定宿主。
2. ARS功能定位：1.4 kb片段中发现的保守序列（如10 bp完全匹配酿酒酵母ARS）解释了其跨物种活性，支持了ARS在酵母中的进化保守性假说。
3. 穿梭载体应用性：pUCARS的高效转化（869 colonies/μg）和自主复制特性（Southern blot验证）为热带假丝酵母的基因操作提供了新工具。
研究结论与价值
1. 科学价值：首次从热带假丝酵母中分离功能性ARS，揭示了其与酿酒酵母ARS的序列保守性，丰富了酵母复制起源的进化认知。
2. 应用价值：pUCARS载体可结合已有整合转化系统，助力热带假丝酵母的基因敲除、过表达等研究，尤其适用于优化二羧酸生产菌株。
3. 技术亮点：开发的Spheroplast转化法（21-869 colonies/μg）和ARS克隆策略为其他非模式酵母的遗传操作提供了参考。
研究亮点
1. 创新性方法：通过BgIII酶切逐步缩小ARS活性区域至1.4 kb，结合保守序列分析，为ARS功能研究提供模板。
2. 跨物种比较：发现热带假丝酵母ARS与酿酒酵母的相似性，暗示其复制机制可能保守。
3. 工业潜力：载体系统可稳定转化，解决了热带假丝酵母遗传工具匮乏的瓶颈，推动其工业应用。
其他价值
研究还发现热带假丝酵母ura3基因与*C. maltosa*高度相似（98.5%），为酵母分类学提供了分子证据（文献14）。此外，多聚体质粒的发现（图4）提示需进一步优化载体稳定性以提升长期表达效率。