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马铃薯四倍体品种特异性转录组及pan-transcriptome重构研究

作者及机构
该研究由Marko Petek、Maja Zagorščak、Živa Ramšak等来自斯洛文尼亚国家生物学研究所（National Institute of Biology）的团队主导，合作单位包括美国印第安纳大学、法国INRA等。研究成果发表于《Scientific Data》（2020年，卷7，文章号249），DOI：10.1038/s41597-020-00581-4。

学术背景
研究领域为植物基因组学与转录组学。马铃薯（Solanum tuberosum）作为全球重要作物，其四倍体栽培品种（group tuberosum）具有高度杂合性，但基因组多样性研究仍不充分。尽管双单倍体（double-monoploid, DM）马铃薯（group phureja）的参考基因组已公布，但其与四倍体栽培品种的遗传差异限制了育种进展。本研究旨在通过整合多组学数据，构建三个四倍体马铃薯基因型（品种Désirée、Rywal和育种系PW363）的品种特异性转录组及pan-transcriptome（全转录组），为马铃薯基因变异探索、高通量分析和育种提供资源。

研究流程
1. 基因模型整合与优化
- 对象：PGSC和ITAG两个马铃薯DM基因组注释（共74,435个基因模型）。
- 方法：通过计算流程合并两者基因模型，手动矫正非重叠区域。最终生成49,322个染色体定位序列的GFF3文件，其中31,442个为ITAG模型，17,880个为PGSC模型。
- 创新点：开发了基于基因组位置的自动化合并算法，并针对复杂簇（如1对多基因）进行人工校对（图1）。

1. RNA-seq数据预处理与组装

   • 样本：三个基因型的Illumina/SOLID短读长数据（约15亿条reads）及Rywal的PacBio长读长数据（140万条全长转录本）。
     
   • 组装策略：
     
     • 短读长数据采用Trinity、Velvet/Oases、RNAspades和CLC Genomics Workbench等多组装器并行分析，测试不同k-mer参数（表1）。
       
     • 长读长数据通过Iso-Seq 3流程处理，使用cupcake tofu脚本去冗余。
       
   • 关键步骤：数字归一化（khmer）降低数据量，优化组装效率。

2. 转录组去冗余与注释

   • 流程：
     
     • 使用EvidentialGene的tr2aacds流程去除冗余转录本，保留代表性序列（main set）和候选可变剪接体（alt set）。
       
     • 通过STARlong将转录本映射至DM基因组，MatchAnnot匹配基因模型，InterProScan进行蛋白结构域注释。
       
     • 自定义R脚本过滤无生物学证据的转录本（如无InterPro或UniProt匹配的序列）。
       
   • 结果：初始组装经18–38倍压缩，最终获得高质量转录组（如Désirée从376万条压缩至5.7万条代表性序列）。

3. Pan-transcriptome构建

   • 方法：将品种特异性CDS与DM基因模型合并，使用CD-HIT-EST（全局相似度90%）聚类，定义”核心转录组”（68,708条序列）和”基因型特异性转录组”（64,529条序列）。
     
   • 验证：BUSCO评估显示核心转录组完整性达98.3%（表6），长读长数据显著减少片段化转录本。

主要结果
1. 转录组多样性：发现约23,000（Désirée）、13,000（PW363）和7,500（Rywal）个DM中未注释的转录本簇，证实四倍体栽培品种存在大量特有基因。
2. 技术验证：
- Sanger测序验证Rywal的NPR1-1基因变异（图4），与组装转录本完全匹配。
- 独立RNA-seq数据映射显示，品种特异性转录组的唯一映射率比DM参考基因组高5.5%（表7）。
3. Pan-transcriptome结构：核心转录组占71%，基因型特异性序列中13%为部分转录本，可能与等位基因变异或低表达相关（图3）。

结论与价值
1. 科学意义：首次系统构建马铃薯四倍体pan-transcriptome，揭示栽培品种间显著的转录组多样性，为研究杂合性与驯化提供新视角。
2. 应用价值：
- 作为RNA-seq、sRNA-seq等分析的精准参考，提升多组学数据解读效率。
- 通过转录本变异设计品种特异性qPCR引物（图5），辅助分子育种。
3. 方法论贡献：融合多组装策略与长读长数据，建立适用于复杂基因组的转录组分析标准流程。

研究亮点
1. 数据规模：整合1.5亿条reads和PacBio全长转录本，覆盖多组织和应激条件。
2. 技术创新：开发自动化基因模型合并流程，优化EvidentialGene参数以减少信息损失。
3. 资源开放：所有数据（FASTA、GTF）发布于FAIRDOMHub（项目_p_strt），遵循CC BY 4.0协议。

其他价值
研究还发现转录组中包含约1%微生物序列（如马铃薯病毒Y），为研究植物-微生物互作提供意外资源（辅助文件3）。代码与中间数据公开，支持研究复现（GitHub链接见原文）。

（注：以上内容严格遵循原文数据，术语如”pan-transcriptome”首次出现时保留英文并标注中文”全转录组”，专业流程名称如”EvidentialGene”不翻译。）