本文报道了一项关于显性负性（dominant negative）G蛋白异源三聚体结构基础的研究。该研究由中国科学院上海药物研究所的Ping Liu和Ming-Zhu Jia等人完成，通讯作者为H Eric Xu和Yi Jiang。论文发表于 *Acta Pharmacologica Sinica*，2016年第37卷，页码1259–1272。

一、研究背景与目的

G蛋白（guanine nucleotide-binding proteins）在G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导中发挥分子开关的作用。非活性状态的G蛋白是由α亚基和βγ亚基组成的异源三聚体，α亚基结合GDP。GPCR被激动剂激活后，促进α亚基中GDP与GTP的交换，导致GTP结合的α亚基与βγ二聚体解离，分别调控下游效应器。α亚基自身的GTPase活性将GTP水解为GDP，使G蛋白恢复非活性状态。自1990年代以来，多个G蛋白循环不同状态的高分辨率晶体结构已被解析，包括活性态、失活态、非活性异源三聚体以及效应器结合态。这些结构为了解异源三聚体G蛋白功能提供了分子基础。

显性负性突变G蛋白在GPCR信号机制研究中发挥了重要作用，但其显性负性特征的结构机制尚未完全阐明。已有多种Gα亚基显性负性突变被报道，例如Gαs中的S54N、Gαo中的S47C、Gαi2中的S48C等。然而，大多数显性负性表型仅通过功能分析进行研究，而结构研究多集中于单个突变的Gα亚基，而非完整的G蛋白异源三聚体。为了深入理解Gi异源三聚体显性负性机制，研究者构建了Gαi1 G203A/A326S双突变体（对应Gαs中的G226A和A366S突变），并解析了其晶体结构。

二、研究流程与方法

该研究主要包括以下步骤：

1. 蛋白表达与纯化：研究者将人Gαi1（含G203A和A326S突变）、大鼠Gβ1和牛Gγ2的开放阅读框进行密码子优化并合成。Gγ2的C端通过9个氨基酸的连接子与Gαi1的N端融合。同时，在Gαi1的C3残基和Gγ2的C68残基引入C到S的点突变，以消除脂质修饰位点，使蛋白以可溶形式表达。利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中共表达Gγ2-Gαi1融合蛋白和Gβ1亚基。通过镍亲和层析、TEV蛋白酶切、再次镍亲和层析以及分子筛层析纯化获得Gαi1β1γ2异源三聚体。

2. 结晶与结构解析：向纯化的蛋白中加入200 μmol/L GDP后进行结晶。晶体通过坐滴法获得，缓冲液条件为2% v/v Tacsimate pH 5.0、0.1 mol/L柠檬酸三钠、16% w/v PEG 3350。X射线衍射数据在上海同步辐射光源BL17U1线站收集。以野生型Gαi1β1γ2异源三聚体结构（PDB代码1GP2）作为分子置换模型进行结构解析，使用CCP4、PHENIX和Coot进行结构精修。

3. 生物物理性质表征：通过静态光散射评估异源三聚体的分子量，结果显示其分子量为90 kDa，与理论值86.4 kDa一致。热稳定性实验显示，在无外源GDP时，显性负性突变体的Tm为55.3 °C，低于野生型的61.1 °C；加入200 μmol/L GDP后，突变体的Tm升至60.0 °C，说明其仍具有结合GDP的能力。

4. 分子动力学模拟：采用全原子mollified adaptive biasing potential（mABP）偏置模拟，使用GROMACS 5.0.5软件和CHARMM36-CAMP力场，对去除螺旋结构域的野生型和突变型GDP结合的Gαi单体各进行1 μs模拟。

5. 额外点突变验证：在显性负性突变体基础上引入D150L、C325I、T48F和D272F四个额外点突变，通过热稳定性实验检测这些突变对GDP结合的影响。

三、主要结果

晶体结构显示，显性负性Gαi1β1γ2异源三聚体与野生型GDP结合异源三聚体（PDB代码1GP2）的总体构象相似，RMSD为1.87 Å。GDP分子占据由Gαi Ras结构域和α螺旋结构域形成的核苷酸结合口袋。

核苷酸结合位点分析：与野生型相比，显性负性突变体的G2和G3盒发生明显位移，switch III区域有7个氨基酸残基不可见。通过LigPlot+分析发现，突变体在G1盒残基S47和T44与GDP的α和β磷酸基团之间形成两个额外氢键，但丢失了G4盒残基N269、K270和D272与鸟嘌呤碱基之间的四个氢键，净减少两个氢键，表明GDP结合亲和力降低。分子动力学模拟显示，A326S突变使G5盒稳定性降低，平均位移为3.77±1.42 Å，而野生型为2.62±0.58 Å。G203A突变通过A203与T181之间的氢键导致G2盒重排。A326S突变中丝氨酸羟基与N269形成氢键，引起G4盒构象变化，同时GDP被推离S326，破坏了D272与鸟嘌呤碱基之间的氢键几何构型。

Gαi与Gβ亚基界面分析：显性负性突变体中Gαi-Gβ界面埋藏面积为1193.4 Ų，大于野生型的1145.3 Ų，表明突变体中Gα-Gβ接触更广泛。在界面1中，αN螺旋发生旋转和位移，D20与R52之间的离子相互作用丢失，但R15与V90和H91形成两个额外氢键。在界面2中，Gβ的N119与Gαi的T182形成两个额外氢键，而E186与W99之间的氢键断裂。总体而言，显性负性突变体的Gαi-Gβ界面比野生型多三对极性接触，说明Gα-Gβ相互作用增强，有利于阻止Gβγ亚基的解离。

受体结合态构象特征：显性负性突变体最显著的结构变化是Gβ和Gγ的N端α螺旋向Gαi亚基发生大幅位移，这一构象与β2肾上腺素受体-Gαsβγ复合物（PDB代码3SN6）中G蛋白N端的构象相似。Gβ的T221与Gγ的E22之间以及Q259与Gβ的R22之间形成的两个额外氢键可能负责这种位移。此外，A326S突变改变了β6-α5环的构象，导致Gα亚基α5螺旋发生位移，尽管幅度小于受体结合态中的位移。这些结果说明显性负性异源三聚体具有受体结合态G蛋白的结构特征。

额外突变的效果：D150L和C325I突变体在加入GDP后仍表现出明显的热稳定性增强，说明这两个残基对GDP结合不是必需的。T48F和D272F突变体在有无GDP条件下Tm值几乎相同，表明这两个突变完全阻断了GDP结合。结构建模显示，F48的苯环与核糖环存在空间位阻，而F272几乎与鸟嘌呤碱基重叠，阻止GDP进入结合口袋。

四、结论与意义

该研究首次报道了G203A/A326S双突变Gαi1β1γ2异源三聚体的晶体结构，揭示了显性负性表型的双重机制。一方面，突变削弱了GDP/GTP与结合口袋残基之间的氢键网络，降低了核苷酸结合亲和力；另一方面，突变增强了Gα与Gβγ亚基之间的相互作用，阻止异源三聚体的解离。同时，显性负性突变体采用更接近受体结合态的构象，使其更容易与激活的GPCR结合。这些特征共同导致显性负性G蛋白通过两种方式阻断信号传导：一是以更强的结合能力螯合Gβγ，阻止野生型Gα与Gβγ结合；二是优先占据激活的GPCR，减少其他野生型G蛋白被激活的机会。此外，T48F和D272F突变的设计验证了结构指导的突变设计策略，为进一步开发更有效的显性负性G蛋白提供了依据。显性负性G蛋白有望通过稳定Gαβγ-受体复合物，为GPCR-G蛋白复合物的结构研究提供新途径。

五、研究亮点

该研究的创新性主要体现在：首次解析了含有双显性负性突变的完整G蛋白异源三聚体结构；将结构观察与分子动力学模拟相结合，阐明了突变对核苷酸结合口袋动态稳定性的影响；基于结构信息理性设计了能够完全阻断GDP结合的额外突变（T48F和D272F）；揭示了显性负性突变体兼具受体结合态构象特征的独特性质。