本文献属于类型a，即单项原创研究的学术论文。该研究由伊斯坦布尔理工大学（Istanbul Technical University）高分子科学与技术系的Şebnem Gülel和化学工程系的Yüksel Güvenilir共同完成，发表于 Journal of Macromolecular Science, Part A: Pure and Applied Chemistry 期刊2024年第61卷第1期，页码69–78，于2023年12月26日在线发表，数字对象唯一标识符（DOI）为10.1080⁄10601325.2023.2296646。
聚合物合成方法在先进材料开发中占有核心地位。传统化学合成法虽然具有成本优势和高产能，但其对不可再生资源的依赖、有毒化学品的使用、高温条件的需求以及大量废弃物的产生，引发了日益严重的可持续性问题。在这一背景下，酶催化聚合作为一种绿色化学替代路线受到广泛关注。酶作为生物催化剂具有高选择性、反应条件温和、可避免副反应等突出优势。
聚酰胺（polyamide）是一类力学性能和热性能优异的工程塑料，广泛用于纤维、薄膜和塑料制品。然而，当前市售聚酰胺几乎全部来源于石油基原料。聚酰胺5.6（polyamide 5.6, PA 5.6）因分子结构中含奇数碳原子而具有优异的阻燃性、吸湿性、易染性、低翘曲性和高流动性，近年来受到工业界越来越多的关注。但关于高分子量聚酰胺5.6的可持续合成方法，文献中仍存在显著的研究空白。
尸胺（cadaverine，戊烷-1,5-二胺）是一种可通过微生物发酵可再生资源（如葡萄糖或植物基材料）生产的生物基二胺单体，也可由L-赖氨酸经脱羧反应获得。脂肪酶（lipase）能够催化酯化和酰胺化反应，其中商品化的Novozym 435（来源于南极假丝酵母的固定化脂肪酶B，即CALB）因其高活性、高特异性和高稳定性而被广泛研究。
本研究旨在以己二酸二甲酯（dimethyl adipate）和尸胺为单体，以Novozym 435为生物催化剂，实现生物基聚酰胺5.6的酶催化合成，探索最佳反应条件以获得高分子量产物，并对所得聚合物进行全面的结构与性能表征。据作者称，这是文献中首次报道通过酶催化合成生物基聚酰胺5.6。
研究者采用Novozym 435固定化脂肪酶催化己二酸二甲酯与尸胺之间的缩聚反应。选择己二酸二甲酯而非己二酸作为酯单体，是因为脂肪酶可更直接地催化二烷基酯与二胺之间形成酰胺键。酯单体与胺单体的摩尔比固定为1:1。反应在无溶剂的一步法体系中进行，除甲醇外不产生任何中间体或副产物。
为系统考察反应条件对聚合效果的影响，实验设计了三因素多水平的条件筛选方案：反应温度设60°C、70°C和80°C三个水平；反应时间设8 h、16 h、24 h和48 h四个水平；酶浓度设5%、10%和20%（w/w）三个水平。每个实验重复三次。具体操作流程为：将己二酸二甲酯、尸胺和Novozym 435酶加入50 mL烧瓶中，通氮气保护，置于预热油浴中在120 rpm搅拌速率下反应。到达设定时间后，加入甲醇终止聚合反应，随后加入甲酸完全溶解聚酰胺产物。由于固定化酶在甲醇和甲酸中均不溶解，通过过滤即可去除酶，再通过蒸发溶剂回收聚酰胺5.6产物。
单体转化率采用重量法计算。具体步骤为：将反应混合物中的聚酰胺产物溶于六氟异丙醇（HFIP），通过过滤除去未反应单体，蒸发溶剂后干燥并称重。单体转化率按照公式（1）计算：单体转化率（%）=（聚酰胺产物重量 / 己二酸二甲酯与尸胺单体的总重量）×100%。
凝胶渗透色谱（GPC）分析：由于聚酰胺不溶于四氢呋喃（THF），研究者采用了Jacobi等人报道的N-三氟乙酰化衍生化方法，将合成的聚酰胺5.6转化为可溶于THF的N-三氟乙酰化聚酰胺5.6（N-TFA-PA56）。具体方法为：将50 mg聚酰胺悬浮于1.5 mL二氯甲烷中，加入过量三氟乙酸酐，在氮气保护下搅拌，几分钟内反应体系变为均相，24 h后反应完成。衍生化产物经溶解、0.45 μm膜过滤后注入GPC系统，以THF为洗脱剂进行测定，获得数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）和多分散指数（PDI）。
傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析：采用KBr压片法制备样品，在Perkin Elmer FTIR光谱仪上于4000–400 cm⁻¹波数范围内以2.0 cm⁻¹分辨率扫描64次。
核磁共振（NMR）分析：使用Agilent/Varian VNMRS 500 MHz核磁共振谱仪进行¹H NMR和¹³C NMR分析，以氘代甲醇（methanol-d4）为溶剂，每个样品溶解约10 mg聚合物。
差示扫描量热（DSC）分析：使用Mettler Toledo DSC3仪器，在氮气氛（流速40 mL/min）下进行，约10 mg样品密封于铝盘中，以10°C/min的速率在25–300°C范围内进行升温–降温–升温循环。从第二次升温曲线获取熔点起始温度（Tm,onset）、熔点峰值（Tm）和熔融焓（ΔHm），从降温曲线获取结晶起始温度（Tc,onset）、结晶峰值温度（Tc）和结晶焓（ΔHc）。结晶度（Xc）按照公式（1）计算，其中100%结晶聚酰胺5.6的标准熔融焓取自文献值188.68 J/g。
热重分析（TGA）：使用Mettler Toledo TGA3+仪器，在氮气氛下以15°C/min的速率从25°C升温至600°C，约15 mg样品密封于铝盘中。
实验结果显示，单体转化率随酶浓度的增加而显著提高。在5%（w/w）酶浓度下，单体转化率范围为9%–34%；在10%（w/w）下为22%–66%；在20%（w/w）下为33%–87%。这一趋势与此前关于Novozym 435酶催化聚合物合成的研究一致。
温度和时间的影响则呈现更为复杂的非线性关系。在60°C下，单体转化率随聚合时间延长持续上升，以20%（w/w）酶浓度为例，8 h时为33%，48 h时升至61%。在70°C下，20%酶浓度的单体转化率在24 h时达到最高的87%，但延长至48 h后降至82%。在80°C下，下降趋势在16 h后即开始显现，20%酶浓度在16 h时达到75%，24 h时为74%，48 h时进一步降至63%。三种酶浓度在70°C和80°C下均表现出类似的时间依赖性下降趋势。
研究者对上述现象提出了多层次机理解释。首先，从60°C升至70°C时单体转化率的提高，可归因于高温降低了反应体系黏度、加速了底物向酶活性位点的扩散。然而，当温度进一步升至80°C时，脂肪酶作为蛋白质发生热变性，导致催化活性的部分或完全丧失。其次，延长反应时间导致转化率下降的机制涉及两个因素：一是南极假丝酵母脂肪酶的结合位点呈椭圆形陡峭漏斗状（尺寸约9.5×4.5 Å），对短链和中链底物具有较高活性，而对长链底物则因空间位阻增大而活性降低；二是产物抑制效应。由于本研究采用间歇式反应体系，聚合产物始终保留在反应体系中，随着产物浓度的积累，产物分子与底物竞争酶的活性位点，抑制正向反应，使平衡向解聚方向移动。这一聚酰胺产物在高温长时间条件下的解聚现象，与文献中关于Novozym 435脂肪酶对聚合物的解聚能力的报道相吻合。
GPC分析结果表明，在最优条件下（70°C、24 h、20% w/w酶浓度）合成的聚酰胺5.6获得了最高的数均分子量（Mn = 11,900 Da）和重均分子量（Mw = 20,300 Da），多分散指数为1.71。在60°C下，分子量随聚合时间延长而持续增加；在70°C下，分子量在24 h达到峰值后开始下降；在80°C下，16 h后分子量即开始下降，与单体转化率的变化趋势高度一致。PDI值范围为1.63–1.71，表明所得聚合物的分子量分布相对较窄。
FTIR分析显示，产物具有典型的酰胺基团特征吸收峰：3318 cm⁻¹（N–H伸缩振动）、1638 cm⁻¹（C=O伸缩振动）、1542 cm⁻¹（N–H弯曲振动）和1277 cm⁻¹（C–N伸缩振动）。2943 cm⁻¹和2868 cm⁻¹处为亚甲基的不对称和对称伸缩振动。936 cm⁻¹处为聚酰胺的特征C–C=O伸缩振动。1736 cm⁻¹处的弱吸收峰表明存在少量寡聚酰胺，而3700–3400 cm⁻¹的宽峰可能源于样品干燥不充分或未反应单体残留。
¹H NMR谱在3.1 ppm、2.1 ppm、1.6 ppm、1.5 ppm和1.2 ppm处显示出与聚酰胺5.6重复单元中各亚甲基质子相匹配的化学位移。其中3.1 ppm对应二胺单元中与酰胺基相邻的亚甲基质子，2.1 ppm对应己二酸酯单元中与羰基相邻的亚甲基质子。¹³C NMR谱在172.0 ppm处显示酰胺羰基碳信号，在39.2 ppm和35.2 ppm处分别显示与酰胺基和羰基相邻的亚甲基碳信号，其余亚甲基碳信号位于27.8、24.4和23.2 ppm。这些数据与此前文献报道的聚酰胺NMR数据高度一致，有力地证实了聚酰胺5.6的结构。
DSC分析显示，酶法合成的聚酰胺5.6的熔融起始温度为230°C，熔融峰值为238°C，熔融焓为67.72 J/g。238°C的熔点处于市售聚酰胺5.6等级191–301°C的熔融温度范围之内。降温曲线显示结晶起始温度为207°C，结晶峰值为200°C，结晶焓为63.86 J/g。根据188.68 J/g的100%结晶标准熔融焓计算，结晶度为36%，此值落在文献报道的聚酰胺5.6结晶度30%–46%的范围内。
TGA分析表明，该聚合物呈现单一的主要分解阶段，最大分解速率温度（Tmax）为418°C，与文献报道的聚酰胺5.6分解温度范围403–445°C一致。
本研究成功实现了以生物基单体尸胺和己二酸二甲酯为原料、以Novozym 435脂肪酶为催化剂的聚酰胺5.6酶催化合成。最佳反应条件确定为70°C、24 h和20%（w/w）酶浓度，在此条件下获得了数均分子量11,900 Da、重均分子量20,300 Da的聚酰胺5.6。FTIR、NMR、DSC和TGA等多项表征结果证实了产物结构正确，其热性能与石油基聚酰胺5.6相当。
本研究的科学价值在于：首次证明了脂肪酶可在无溶剂条件下催化生物基单体合成具有较高分子量的聚酰胺5.6，拓展了酶催化聚合在聚酰胺合成领域的应用范围；系统阐明了反应温度、时间和酶浓度对聚合反应的影响规律及其背后的酶学机制，特别是产物抑制和酶热变性对反应的负向调控作用。从应用价值来看，该方法为替代传统石油基聚酰胺的可持续生产路线提供了重要实验依据，有望推动生物基聚酰胺在塑料工业中的实际应用，降低聚合物生产对化石资源的依赖和环境负荷。
本研究的主要亮点包括：（1）首次报道了酶催化合成生物基聚酰胺5.6，填补了文献空白；（2）采用无溶剂的一步法反应体系，避免了有机溶剂的使用，显著降低了环境影响；（3）系统建立了温度–时间–酶浓度三因素的反应条件优化方案，获得了明确的构效关系；（4）通过N-三氟乙酰化衍生化策略解决了聚酰胺在GPC分析中不溶于THF的技术难题，实现了分子量的准确测定；（5）对转化率随反应时间延长而下降的现象提出了产物抑制与酶结合位点空间位阻的双重机理解释，深化了对脂肪酶催化缩聚反应动力学特征的认识。