该研究于2023年3月13日在线发表于期刊 PNAS，论文标题为“Peroxisomal metabolic coupling improves fatty alcohol production from sole methanol in yeast”。通讯作者为来自中国科学院大连化学物理研究所生物技术研究部（Division of Biotechnology, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences）以及相关国家重点实验室的周雍进研究员。主要作者包括翟晓欣、高娇琦、李云霞、Martin Grininger和周雍进。
本研究的学术领域为应用生物科学、合成生物学与代谢工程。甲醇因其可通过环境友好方式获得而被认为是生物制造的理想原料。然而，甲醇及其氧化中间体甲醛的毒性，以及甲醇代谢的复杂性，使得在微生物细胞工厂中高效过量生产目标化学品面临巨大挑战。高级脂肪醇（Fatty alcohol）是一种广泛应用于洗涤剂、乳化剂和个人护理产品的重要化学品，目前主要依赖于化石燃料或植物油进行化学合成。利用微生物细胞工厂，以甲醇等一碳化合物为原料进行生物合成，为可持续生产提供了潜在路径。研究团队前期工作表明，在多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha）中，将脂肪醇生物合成途径置于细胞质会导致生产水平低下，这可能与扰乱胞质脂肪酸代谢以及与甲醇代谢在空间上隔离有关。而甲基营养酵母中，甲醇的利用主要发生在过氧化物酶体（Peroxisome）中。因此，本研究旨在探索是否可以通过将脂肪醇生物合成途径区室化至过氧化物酶体，实现甲醇利用与产物合成的耦合，从而提高脂肪醇的产量，并揭示过氧化物酶体代谢工程在甲醇生物转化中的潜力。
详细研究流程如下： 1. 脂肪醇胞质合成途径的初步构建与瓶颈识别： 研究首先在多形汉逊酵母中于胞质构建了三条不同的脂肪醇生物合成途径进行对比，途径分别依赖于羧酸还原酶（CAR pathway）、脂肪酰辅酶A还原酶（FAR pathway）以及另一种脂肪酰辅酶A还原酶（FACOAR pathway）。研究发现，来自仓鸮（Tyto alba）的Tafar1基因（FAR途径）效果最佳，其产量是其他两个基因的25倍。产生的脂肪醇主要为十六醇（C16:0，占52%）、十八醇（C18:0，占41%）和油醇/亚油醇（C18:1 & 2，占7%）。进一步研究发现，脂肪酸醛还原为脂肪醇的步骤是瓶颈。过表达酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的ScADH5基因，或敲除酵母内源的Adh6-3基因，都能显著提高产量。最终，将Tafar1和ScADH5整合到基因组中，构建了菌株ZX-F33。该菌株在以葡萄糖为碳源时产量尚可（142 ± 23 mg/L），但在以甲醇为唯一碳源时，产量极低且生长受到抑制。这证实了胞质合成途径不适合以甲醇为原料的生产，协调甲醇代谢与生物合成途径至关重要。
2. 过氧化物酶体区室化策略的实施与优化： 鉴于过氧化物酶体是甲基营养酵母中甲醇同化和脂肪酸β-氧化的主要场所，研究团队将脂肪醇合成关键酶（Tafar1和ScADH5）通过C末端信号肽Per2靶向至过氧化物酶体。荧光显微镜观察证实了定位的成功。结果显示，与胞质途径相比，过氧化物酶体途径的脂肪醇产量提高了3.9倍以上，且使用甲醇诱导型启动子P_OPTAL1驱动的效果优于组成型启动子P_GAP。然而，过氧化物酶体途径也导致了菌株在以甲醇为培养基时生长减缓25%，表明工程化改造对细胞造成了一定压力。
3. 增强过氧化物酶体内前体供应与细胞鲁棒性： 为了提升产量，研究系统性地增强了过氧化物酶体内脂肪醇合成前体——脂肪酰辅酶A（fatty acyl-CoA）的供应。首先，敲除了消耗脂肪酰辅酶A的支路基因，例如编码酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶的ARE基因，使产量提高了22%。其次，基于之前的研究，敲除与磷脂降解和锌代谢相关的LPL1和IZH3基因，以维持过氧化物酶体膜完整性并增强细胞对甲醇的耐受性。该操作使菌株（ZX-F51）生长和产量得到改善。最后，过表达过氧化物酶体脂肪酰辅酶A输入蛋白Pxa1,2，进一步将产量提升了21%。在20 g/L甲醇浓度下培养，这些改造策略的正面效应更为明显。
4. 提高过氧化物酶体内辅因子NADPH的供应： 脂肪醇合成需要NADPH作为还原力。研究尝试在过氧化物酶体内增强NADPH供应。一是过表达来自酿酒酵母的NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶ScIdp2，并将其靶向至过氧化物酶体（ScIdp2per2），这一操作使产量提升了15-17%。二是构建了一个过氧化物酶体“苹果酸循环”，通过表达苹果酸酶（Rtme1）、苹果酸脱氢酶（Mdh3）和丙酮酸羧化酶（Pyc1），旨在将NADH和ATP转化为NADPH。该循环在特定背景下使产量提升了9%。综合前体与辅因子供应优化，菌株ZX-F71在20 g/L甲醇培养基中产量达到279 ± 1 mg/L。
5. 改善甲醇利用与甲醛同化： 研究发现，过氧化物酶体工程化加剧了甲醛积累（菌株ZX-F38中比野生型高得多）并延缓了甲醇消耗，说明工程化引起了代谢压力。之前增强细胞鲁棒性的改造（敲除LPL1和IZH3）部分缓解了这一问题。为进一步减少甲醛毒性并加速甲醇利用，研究过表达了甲醇代谢关键酶——二羟丙酮合酶基因DAS2。在菌株ZX-F75中，这一操作显著降低了甲醛积累，加快了甲醇消耗速率，并提高了发酵对数期的脂肪醇产量，但最终总产量与未过表达DAS2的菌株（ZX-F71）相比无显著差异，推测可能受限于甲醇或其他营养供应。
6. 分批补料发酵验证高产潜力： 为了避免长期发酵中尿嘧啶补充的麻烦，构建了原养型菌株ZX-F75U。在摇瓶中进行分批补料发酵时，过表达DAS2的菌株ZX-F75U表现出比对照菌株更好的生长和更高的脂肪醇产量（601 ± 11 mg/L vs 430 ± 56 mg/L）。最终，在1升生物反应器中进行的分批补料发酵中，菌株ZX-F75U消耗了225 ± 1 g/L甲醇，在279小时产生了3.6 ± 0.2 g/L的脂肪醇，产量（16 mg/g甲醇）和生产强度（12.9 mg/L/h）均达到报道的最高水平。产物中76%存在于细胞内，组分以十六醇（52%）和十八醇（43%）为主。
本研究的主要结果层层递进，逻辑紧密：结果1 确认了胞质途径在甲醇培养基中的失败，引出了空间耦合的必要性；结果2 证明了过氧化物酶体区室化策略的有效性，但同时也暴露出代谢压力和生长受损的问题；结果3和结果4 通过增强前体和辅因子供应，直接解决了合成途径的瓶颈，显著提高了产量，表明过氧化物酶体代谢网络具有可塑性和优化空间；结果5 通过改善甲醛同化，缓解了工程化带来的毒性压力，优化了甲醇代谢流，表明协调产物合成与宿主代谢健康的重要性；结果6 通过发酵工艺优化，最终实现了目前微生物以甲醇为唯一碳源合成脂肪醇的最高产量，验证了整体工程策略的工业应用潜力。每一步的结果都基于前一步的发现，并导向下一阶段的工程目标，形成了一个完整的“发现问题（胞质途径低效）-提出策略（过氧化物酶体区室化）-优化策略（增强供应、改善耐受）-验证策略（高产发酵）”的研究闭环。
研究的结论是，通过将脂肪醇生物合成途径区室化至过氧化物酶体，并系统性地重新布线细胞代谢以耦合甲醇利用与产物合成，可以成功构建高效的多形汉逊酵母细胞工厂，实现从单一甲醇原料高产脂肪醇。这证明了过氧化物酶体作为“微工厂”用于甲醇生物转化的可行性和巨大潜力。该策略通过将合成途径与底物代谢场所共定位，减少了中间体损失和胞质竞争，但同时也需要精细的代谢工程来平衡合成通量与细胞健康。
本研究的科学价值与应用价值在于：首先，它为解决甲醇细胞工厂构建中产物合成与底物代谢脱节这一共性难题提供了一个行之有效的工程策略——过氧化物酶体代谢耦合。其次，它深入揭示了在甲基营养酵母这一苛刻环境下进行过氧化物酶体工程所特有的挑战（如甲醛积累、生长抑制），并提供了相应的解决方案（增强鲁棒性、促进甲醛同化）。第三，研究展示了如何通过全局代谢重编程（增强前体、辅因子供应，优化底物利用）来最大化区室化合成途径的效率，为其他化学品在过氧化物酶体中的生产提供了方法论参考。最后，研究实现了脂肪醇从甲醇生物合成的最高产量，向可持续的甲醇生物制造迈出了坚实的一步，具有明确的工业应用前景。
本研究的亮点包括：重要发现：首次系统证明并优化了过氧化物酶体区室化策略对于甲醇基脂肪醇生物合成的决定性提升作用，并实现了破纪录的产量。方法新颖性：研究并非简单地将途径靶向过氧化物酶体，而是结合了前体工程、辅因子工程、毒性缓解和甲醇代谢工程的多层次、系统性代谢重编程，工作非常全面和深入。研究对象的特殊性：选用甲基营养酵母多形汉逊酵母和有毒底物甲醇作为研究系统，挑战性高，其研究成果对非传统酵母和C1原料的生物制造领域具有重要指导意义。
其他有价值的内容包括：研究过程中对多个关键酶（如不同来源的还原酶、内源ADH酶）进行了筛选和功能验证；发现了过表达异源IDP优于内源IDP的有趣现象，暗示了维持内源酶稳态的重要性；通过详细的发酵动力学数据（生长、甲醇消耗、甲醛积累、产物合成）清晰地展示了各工程步骤对细胞生理和代谢的影响，为理解工程菌株的代谢表型提供了丰富信息。此外，文中提到的相关专利（202211580749.9）也体现了该工作的应用价值。