该研究报告于2022年3月17日发表在《国际分子科学杂志》（*International Journal of Molecular Sciences*）上。研究由中国科学院海洋研究所（实验海洋生物学重点实验室）、青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋生物学与生物技术实验室以及中国科学院大学地球科学学院的苏满文、张珺（通讯作者）、袁剑波、张晓曦和李富花等人合作完成。研究聚焦于太平洋白对虾（*Litopenaeus vannamei*）中胰岛素样肽（ILP）的功能，旨在探索其在维持血淋巴（hemolymph）葡萄糖稳态中的作用。鉴于甲壳动物与昆虫同属节肢动物门，而昆虫血淋巴糖主要以海藻糖为主并受ILP调控，但甲壳动物血淋巴糖组成及其调节机制尚不清晰，特别是在全球最重要的经济虾类——凡纳滨对虾中，了解其碳水化合物代谢系统对优化养殖技术至关重要。因此，本研究旨在：1）明确凡纳滨对虾血淋巴糖的主要成分；2）探究血淋巴葡萄糖浓度在不同处理下的变化；3）分析胰岛素样肽基因（*LvILP*）及葡萄糖代谢关键基因的表达响应；4）验证LvILP蛋白是否具有类似脊椎动物胰岛素的降血糖功能，从而阐明ILP在甲壳动物葡萄糖稳态维持中的保守性角色。
本研究设计并执行了多步骤、系统性的实验流程，涵盖了血淋巴成分分析、基因克隆与表达、多种体内干预实验以及分子生物学检测。
第一步：血淋巴糖成分分析与LvILP基因克隆鉴定。 研究人员首先从健康凡纳滨对虾中采集血淋巴样本（3个生物学重复，每个重复来自4只虾混合）。使用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对样本中的碳水化合物进行定性和定量分析，旨在确定血淋巴糖的组成。这是首次在凡纳滨对虾中系统检测其血淋巴糖组分。同时，从实验室已有的凡纳滨对虾基因组和转录组数据中，通过生物信息学比对和保守结构域预测，鉴定出胰岛素样肽基因。随后，从虾的眼柄组织提取总RNA，逆转录为cDNA，通过PCR扩增克隆得到完整的*LvILP*基因序列，并将其连接到pMD19-T载体中进行测序验证。这一步骤为后续的功能研究提供了目标基因和基础生理数据。
第二步：饥饿应激实验。 为探究虾自身维持血糖稳态的能力以及*LvILP*在应对能量短缺时的作用，研究人员设置了持续4天的饥饿实验。将60只虾分为正常投喂组（对照组）和饥饿处理组（实验组）。在饥饿开始后的0、6、12、24、48、72和96小时分别取样。每次取样时，收集3只虾的血淋巴混合为一个样本，使用葡萄糖微量检测试剂盒测定血糖浓度。同时，采集眼柄、肝胰腺和肠道组织（同样3只虾混合为一个样本），用于后续检测基因表达。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，检测*LvILP*以及四个葡萄糖代谢关键基因的表达水平，这四个基因分别是：糖原合成酶基因（*GS*）、糖原磷酸化酶基因（*GP*）、磷酸果糖激酶基因（*PFK*）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（*PEPCK*）。内参基因选用18S rRNA。该实验旨在模拟能量摄入中断条件下，虾体内血糖调控系统的动态响应。
第三步：外源葡萄糖注射实验。 为测试虾清除过高血糖的能力及*LvILP*在此过程中的响应，研究人员将120只禁食12小时的虾分为两组。实验组按体重注射葡萄糖溶液（0.75 g/kg），对照组注射等体积无菌水。在注射后的0、5、10、20、60、180和420分钟采集血淋巴和组织样本，检测血糖浓度及上述五个基因的表达变化。该实验旨在观察虾在面临血糖急剧升高挑战时，其快速调节机制的激活情况。
第四步：外源牛胰岛素注射实验。 为验证外源胰岛素是否能在虾体内发挥类似功能，研究人员将90只虾先禁食12小时，再复喂1小时以使其血糖处于较高水平。随后分组，实验组注射牛胰岛素（1.5 IU/kg），对照组注射无菌水。在注射后0、10、30、60和120分钟取样，检测血糖变化以及*LvILP*和葡萄糖代谢基因的表达。该实验旨在探究外源胰岛素对虾血糖及内源信号通路的影响。
第五步：重组LvILP蛋白的表达、纯化与功能验证。 为直接证明凡纳滨对虾自身的ILP蛋白具有活性，研究人员构建了LvILP的重组表达系统。将*LvILP*基因克隆到pMAL-c5x-His载体中，转化至大肠杆菌进行诱导表达。通过超声破碎细胞、亲和层析（IMAC树脂）纯化，获得了重组MBP-LvILP融合蛋白以及作为阴性对照的MBP蛋白，并通过SDS-PAGE电泳进行鉴定。随后进行功能验证实验：将120只虾分为三组，分别为PBS对照组、MBP蛋白注射组和重组LvILP蛋白注射组。虾只处理方式同牛胰岛素实验（禁食-复喂）。注射后于0、30、60、120和360分钟取样，检测血糖变化，并在注射后12小时检测葡萄糖代谢基因的表达。该实验是本研究的关键，旨在直接证实虾源ILP蛋白的生物学活性。
第六步：RNA干扰（RNAi）实验。 为探究抑制内源*LvILP*表达对血糖稳态的影响，研究人员合成了针对*LvILP*的双链RNA（dsRNA），并以增强型绿色荧光蛋白基因（*dsEGFP*）的dsRNA作为阴性对照。将虾分为三组，分别注射PBS、*dsEGFP*和*dsLvILP*。在注射后0、2、6、12和24小时取样，检测血糖和基因表达。更为重要的是，在干扰24小时后（此时*LvILP*表达被显著抑制），再向这些虾注射外源葡萄糖，观察其清除过量葡萄糖的能力是否受损。该实验从基因功能缺失的角度，反向验证*LvILP*在血糖调节中的作用。
数据分析：所有实验数据均采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并使用Bonferroni或Tamhane‘s T2法进行事后多重比较。图表使用GraphPad Prism 7绘制。基因相对表达量采用2−ΔΔCt方法计算。
本研究取得了一系列系统性的结果，层层递进地揭示了凡纳滨对虾血淋巴葡萄糖稳态的调节机制及LvILP的核心作用。
血淋巴糖组成分析结果显示，在凡纳滨对虾血淋巴中检测到六种碳水化合物，其中葡萄糖浓度最高（1.726 mmol/L），其次是麦芽糖（0.151 mmol/L）和海藻糖（0.073 mmol/L）。葡萄糖浓度是麦芽糖的11.46倍，是海藻糖的23.49倍。这一关键发现表明，葡萄糖是凡纳滨对虾血淋巴糖的主要成分，这与昆虫以海藻糖为主的情况截然不同，提示水生甲壳动物与陆生昆虫在能量运输形式上可能存在显著的进化适应差异。这一结果为后续研究聚焦于“葡萄糖”稳态调控奠定了基础。
饥饿实验结果揭示了虾具有维持血糖稳态的内在能力。在正常投喂期间，虾的血淋巴葡萄糖浓度稳定在0.99–1.64 mmol/L之间。饥饿开始后，血糖浓度在12小时内先升高至峰值（约为0小时的3.45倍），随后在24-72小时内逐渐下降并恢复至初始水平。这种“先升后降”的模式表明，饥饿初期虾可能通过调动内源储备（如糖原）来应对应激，而长期饥饿则激活了严格的节约机制以维持基础血糖水平。基因表达分析与此生理变化相吻合：在饥饿初期（6-12小时）血糖上升时，*LvILP*的表达显著下降，这可能减弱了其降血糖作用，允许血糖暂时性升高；而与糖原分解相关的*GP*基因表达上调。当饥饿持续（24-72小时）血糖开始下降时，*LvILP*表达回升，同时糖原合成（*GS*）、糖酵解（*PFK*）和糖异生（*PEPCK*）相关基因表达均发生显著变化，表明虾体通过复杂的代谢重组来应对能量危机，其中*LvILP*的表达动态调整可能是协调这一过程的重要信号。
外源葡萄糖注射实验进一步证实了虾具备快速清除高血糖的强大能力。注射葡萄糖5分钟后，实验组血糖飙升至对照组的5.28倍，但仅在60分钟内就迅速恢复到与对照组相同的水平。这一高效的清除过程伴随着基因表达的快速响应：注射后10分钟，*LvILP*和*GS*的表达立即上调，提示机体一方面通过上调ILP信号来启动降血糖程序，另一方面可能立即将过量葡萄糖转化为糖原储存。至60分钟血糖恢复正常时，所有四个葡萄糖代谢基因（GS, GP, PFK, *PEPCK*）的表达均显著升高，表明整个葡萄糖代谢网络被全面激活以处理过剩的葡萄糖。这些结果说明，*LvILP*能敏锐地响应血糖升高，并可能通过调控下游代谢基因的表达来驱动葡萄糖的清除。
牛胰岛素和重组LvILP蛋白注射实验提供了LvILP具有降血糖功能的直接证据。在虾处于摄食后高血糖状态时，注射牛胰岛素或重组LvILP蛋白均能加速血糖的下降速度，注射后30分钟，实验组的血糖显著低于对照组。这表明外源牛胰岛素和虾自身的LvILP蛋白都能在虾体内发挥降低血淋巴葡萄糖的作用。分子机制上，注射牛胰岛素后30分钟，*GS*、*PFK*和*PEPCK*基因表达显著上调，而*LvILP*自身表达被抑制，这可能是一种反馈调节。注射重组LvILP蛋白12小时后，也观察到了*GP*、*PFK*和*PEPCK*表达的上调。这两组实验的结果高度一致，强有力地证明LvILP蛋白具有类似胰岛素的生物活性，并能影响葡萄糖代谢关键基因的表达。
RNA干扰实验从反面验证了LvILP在血糖调节中的必要性，并揭示了其作用的特殊性。干扰LvILP 24小时后，尽管其表达量被敲低至对照组的10%左右，基础状态下的血淋巴葡萄糖浓度并未发生显著变化。这一看似矛盾的现象提示，虾体内可能存在其他补偿机制或因子（如甲壳动物高血糖激素CHH）来维持基础血糖的稳定，LvILP并非唯一的调控者。然而，当给这些*LvILP*被干扰的虾注射外源葡萄糖时，其清除过量葡萄糖的能力明显受损：在注射后60和120分钟，干扰组的血糖水平显著高于对照组。这一关键结果表明，LvILP对于应对血糖突然升高的挑战、快速恢复血糖稳态是必需的。同时，干扰*LvILP*后，*GP*和*PFK*的表达显著下调，这从分子层面解释了其清除能力受损的原因：LvILP的缺失导致了下游糖原分解和糖酵解途径的激活不足。
本研究的结论是：在太平洋白对虾中，葡萄糖是其血淋巴糖的主要成分；虾拥有强大的机制来维持血淋巴葡萄糖稳态，能够应对饥饿、外源葡萄糖负荷等多种挑战；其中，胰岛素样肽（LvILP）发挥着与脊椎动物胰岛素相似的功能，能够降低血淋巴葡萄糖水平；LvILP通过调控糖原合成、糖原分解、糖酵解和糖异生等相关代谢基因的表达来履行这一功能。虽然LvILP并非维持基础血糖稳态的唯一因子，但它在应对高血糖应激、快速清除多余葡萄糖的过程中扮演着不可或缺的角色。
这项研究具有重要的科学价值和应用价值。在科学上，它首次系统阐明了经济甲壳动物凡纳滨对虾的血淋巴糖组成，并将胰岛素样肽的功能研究从昆虫扩展至甲壳动物，证实了ILP在节肢动物门内调控血糖稳态功能的保守性，为比较内分泌学和进化生物学提供了重要案例。研究揭示了甲壳动物与昆虫在能量代谢策略上的显著差异（葡萄糖 vs. 海藻糖），这可能与它们不同的生活环境（水生稳定 vs. 陆生多变）相关。在应用上，该研究增进了我们对虾类碳水化合物代谢和能量稳态调节机制的理解，为优化对虾饲料配方（如碳水化合物源的选择和添加）、改善养殖管理策略（如投喂频率和应激管理）以促进虾类健康生长、提高养殖效益提供了理论依据。对于应对养殖中可能出现的代谢紊乱问题也具有潜在的指导意义。
本研究的亮点在于：1）研究对象的产业重要性：聚焦全球养殖产量最高的凡纳滨对虾，研究问题直指产业基础生理知识短板。2）研究设计的系统性与逻辑严密性：从成分分析到基因克隆，从多种体内处理（饥饿、葡萄糖注射、激素/蛋白注射、基因干扰）到多层面检测（生理指标、基因表达），构成了一个完整的证据链，全方位揭示了LvILP的功能。3）关键实验的直接证明：成功表达并纯化具有生物活性的重组LvILP蛋白，并直接证实其降血糖作用，这是证明甲壳动物自身ILP功能的最有力证据之一。4）发现的现象具有深度：不仅证明了LvILP的降糖功能，还通过RNAi实验发现了其在基础稳态维持和应激响应中可能扮演的不同角色，提示了调节网络的复杂性，为后续研究指明了方向。5）清晰的比较生物学视角：始终将甲壳动物的发现与昆虫和脊椎动物的已知知识进行对比，突出了进化适应上的异同，提升了研究的理论高度。
此外，研究中关于饥饿和外源葡萄糖处理下，糖异生关键基因*PEPCK*的显著上调是一个值得深入探讨的发现。它提示即使在处理多余葡萄糖或能量短缺时，糖异生途径也可能被激活，这可能是一种维持代谢中间物平衡或为特定组织供能的策略，这为了解甲壳动物复杂的代谢网络提供了新的线索。