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CRISPR/Cas9系统中单链引导RNA（sgRNA）在植物体内的天然加工机制研究

一、作者与发表信息

本研究由Will B. Cody和Herman B. Scholthof（通讯作者）完成，两人均来自美国德克萨斯农工大学（Texas A&M University）植物病理与微生物学系。研究发表于Plant Physiology期刊，2020年10月，卷184，页码1194–1206。DOI编号为10.1104/pp.20.00150。研究获得了美国农业部的资助（项目编号2017–67011–26026和2015–67013–22916）。

二、学术背景

研究领域：基因编辑与植物分子生物学。
研究动机：CRISPR/Cas9系统的核心是单链引导RNA（sgRNA）与Cas9蛋白形成的复合物，但传统观点认为sgRNA的5’和3’端非互补核苷酸悬垂（overhang）会抑制Cas9的催化活性。因此，现有sgRNA递送策略需通过工程化手段去除这些悬垂序列。然而，作者此前利用烟草花叶病毒（TMV）载体在烟草（Nicotiana benthamiana）中同时表达绿色荧光蛋白（GFP）和sgRNA时，意外发现含悬垂的sgRNA仍能高效介导基因编辑。这一现象与主流理论矛盾，促使团队探究其机制。
科学问题：植物体内是否存在天然机制可加工sgRNA的5’悬垂，从而激活Cas9/sgRNA复合物？
研究目标：
1. 验证5’和3’悬垂对Cas9活性的体外影响；
2.揭示植物体内sgRNA的加工位点与细胞定位；
3.解析可能的加工机制（如外切核酸酶XRN1的作用）；
4.探讨该机制的普适性（如核启动子驱动的转录本是否适用）。

三、研究流程与方法

1. 体外验证悬垂对Cas9活性的影响

• 实验设计：构建含不同悬垂的sgRNA（5’悬垂、3’悬垂、双悬垂或无悬垂），通过T7 RNA聚合酶合成RNA，与纯化Cas9蛋白及靶DNA（mgfp5基因片段）孵育，检测DNA切割效率。
  
• 关键方法：使用TMV载体衍生的转录模板，设计特异性引物（如T7-F1/R2扩增含5’悬垂的sgRNA）。
  
• 结果：仅含5’悬垂的sgRNA完全抑制Cas9活性，而3’悬垂无影响（图1c）。高浓度5’悬垂sgRNA仍无法恢复活性（图1d），排除剂量效应。
  

2. 植物体内sgRNA的加工验证

• 样本处理：将表达Cas9的载体（phcoCas9）与TMV-sgRNA载体（trbo-g-3’ggfp）共浸润烟草叶片，3天后取样。
  
• 免疫共沉淀（IP）：用Cas9抗体富集复合物，提取结合RNA，通过RT-PCR检测sgRNA的5’端完整性。
  
• 发现：Cas9结合的sgRNA缺乏预期的5’悬垂（图2d），且加工后的sgRNA富集于细胞质（图3b），核定位信号（NLS）缺失的Cas9仍能结合加工后的sgRNA（补充图S1e），表明加工不依赖核内靶标识别。
  

3. 核启动子驱动的sgRNA加工

• 构建设计：用拟南芥U6核启动子驱动GFP-sgRNA融合转录本（phco-U6-gfp-ggfp），与Cas9共表达。
  
• 结果：尽管编辑效率低于无悬垂对照（17–30% vs. 33–40%），但证实核转录本仍可被加工（图4c），说明加工机制不限于病毒载体。
  

4. XRN1外切核酸酶的作用

• 体外实验：用XRN1处理含5’悬垂的sgRNA，发现成熟sgRNA（无悬垂）抵抗降解，而前体被有效切割（图5a）。
  
• 植物实验：细胞质Cas9-sgRNA复合物中的RNA对XRN1处理表现出抗性（图5c），支持XRN1可能参与天然加工。
  

四、主要结果与逻辑链条

1. 体外数据：5’悬垂直接抑制Cas9活性，而3’悬垂无影响→植物体内活性sgRNA需5’加工。
   
2. 体内IP：Cas9结合的sgRNA均缺失5’悬垂→加工发生于Cas9结合前或伴随结合。
   
3. 亚细胞定位：加工主要发生在细胞质→排除核内RNase H依赖的机制。
   
4. XRN1实验：成熟sgRNA的结构抗性可能是加工基础→提出“Cas9屏蔽”或sgRNA固有稳定性的模型（图6）。
   

五、结论与价值

科学意义：
- 首次揭示植物体内存在天然sgRNA 5’加工机制，挑战了“必须人工去除悬垂”的教条。
- 提出XRN1类外切核酸酶可能通过选择性降解前体sgRNA参与加工，为CRISPR系统进化提供新见解。
应用价值：
- 简化sgRNA递送设计，避免复杂的工程化步骤（如核酶或tRNA支架）。
- 为多sgRNA串联表达提供理论支持（如病毒载体中单转录本的多重编辑）。

六、研究亮点

1. 颠覆性发现：证明含悬垂的sgRNA可通过天然加工激活Cas9，修正了领域认知。
   
2. 方法创新：结合病毒载体、亚细胞分馏和XRN1体外 assay，多角度验证假说。
   
3. 普适性启示：机制可能保守于其他真核生物（如人类细胞），拓宽CRISPR工具优化思路。
   

七、其他价值

• 为细菌天然CRISPR系统中tracrRNA的稳定性提供类比证据（如抗XRN1降解）。
  
• 提示未来可探索植物内源RNA降解通路（如DCP2去帽酶）对CRISPR效率的调控。
  

该研究通过严谨的实验设计，不仅解决了理论与实践的矛盾，还为基因编辑技术的优化提供了新范式。