本文由Qi Li、Bingbing Sun、Jun Chen、Yiwen Zhang、Yu Jiang和Sheng Yang等人共同完成，研究团队分别来自四川师范大学、中国科学院合成生物学重点实验室以及上海生物科学研究所湖州工业生物技术中心。该研究于2021年3月25日发表在《Acta Biochimica et Biophysica Sinica》期刊上，题为“A Modified pCAS/pTARGET System for CRISPR-Cas9-Assisted Genome Editing in Escherichia coli”。

研究背景

CRISPR-Cas9系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的天然防御机制，近年来被广泛应用于基因组编辑。此前，研究团队开发的pCAS/pTARGET系统在大肠杆菌MG1655中表现出高效的基因组编辑能力，但在大肠杆菌BL21(DE3)中却无法有效工作。BL21(DE3)是一种常用于分子生物学和生物技术应用的菌株，因此开发一种适用于该菌株的基因组编辑工具具有重要的科研和工业应用价值。

研究目标

本研究旨在通过改进pCAS/pTARGET系统，开发一种适用于BL21(DE3)及其他大肠杆菌菌株的CRISPR-Cas9基因组编辑工具。具体目标包括：1）解决BL21(DE3)中pCAS/pTARGET系统的泄漏表达问题；2）扩展该系统的应用范围至其他大肠杆菌菌株及肠杆菌科其他物种；3）优化质粒消除流程，缩短实验时间。

研究方法

研究团队对pCAS/pTARGET系统进行了多项改进，开发了新的pECCAS/pECgRNA系统。具体改进包括： 1. 将pCAS中的gRNA-PMB1启动子替换为严格调控的prhab启动子，以减少泄漏表达。 2. 将pCAS的复制子从温度敏感型改为非温度敏感型，以缩短实验时间。 3. 在pCAS中插入sacB基因，用于质粒消除时的反选择标记。 4. 将pTARGET中的N20特异性序列替换为ccdB基因，简化新gRNA质粒的构建。

实验流程包括质粒构建、基因组编辑、电穿孔、突变体验证和质粒消除。研究团队首先构建了pECCAS和pECgRNA质粒，并通过电穿孔将其导入目标菌株中。随后，通过阿拉伯糖诱导λ-Red系统进行基因组编辑，并通过菌落PCR和DNA测序验证突变体。最后，优化了质粒消除流程，将质粒消除时间从约60小时缩短至约32小时。

研究结果

1. 系统改进验证：研究团队发现，pCAS/pTARGET系统中的gRNA-PMB1在BL21(DE3)中确实存在较高的泄漏表达，导致pTARGET质粒被Cas9切割，无法获得转化子。改进后的pECCAS/pECgRNA系统显著降低了泄漏表达，成功实现了BL21(DE3)中cada和maea基因的编辑。
2. 系统扩展应用：pECCAS/pECgRNA系统不仅适用于BL21(DE3)，还成功应用于其他大肠杆菌菌株，包括BL21 Star™(DE3)、MG1655、DH5α、CGMCC3705、Nissle1917和ATCC9637。此外，该系统还成功编辑了肠杆菌科另一物种Tatumella citrea DSM13699的基因组。
3. 质粒消除优化：研究团队开发了一种两步质粒消除方法，首先消除pECgRNA，随后消除pECCAS。进一步优化后，实现了pECCAS和pECgRNA的同时消除，将质粒消除时间从约60小时缩短至约32小时。

研究结论

本研究成功开发了一种改进的CRISPR-Cas9基因组编辑系统pECCAS/pECgRNA，解决了pCAS/pTARGET系统在BL21(DE3)中的泄漏表达问题，并扩展了其应用范围至多种大肠杆菌菌株及肠杆菌科其他物种。优化后的质粒消除流程显著缩短了实验时间，使整个基因组编辑流程从约7.5天缩短至约5.5天。该系统为肠杆菌科物种的研究和应用提供了高效、便捷的基因组编辑工具。

研究亮点

1. 系统改进：通过替换启动子、改变复制子和插入反选择标记，显著降低了gRNA的泄漏表达，提高了系统的稳定性和编辑效率。
2. 广泛适用性：pECCAS/pECgRNA系统不仅适用于BL21(DE3)，还可用于多种大肠杆菌菌株及肠杆菌科其他物种，具有广泛的适用性。
3. 时间效率提升：优化后的质粒消除流程将实验时间大幅缩短，显著提高了实验效率。

研究意义

本研究开发的pECCAS/pECgRNA系统为肠杆菌科物种的基因组编辑提供了高效、便捷的工具，具有重要的科研和工业应用价值。该系统不仅解决了BL21(DE3)中pCAS/pTARGET系统的局限性，还为其他大肠杆菌菌株及肠杆菌科物种的基因组编辑提供了新的解决方案，有望加速相关领域的研究和应用进展。