本研究由来自深圳大学、中国科学院深海科学与工程研究所等机构的尚陈静、李思慧、李春元、Quaid Hussain*、陈鹏宇、Muhammad Azhar Hussain及Jackson Nkoh Nkoh等人合作完成，并于2024年在期刊《BMC Plant Biology》（第24卷，第805期）上以开放获取的形式发表。
该研究属于植物分子生物学与遗传学领域，聚焦于植物对非生物胁迫（盐和重金属）的耐受机制。土壤盐渍化和重金属污染是影响全球农业生产和生态环境的重大问题。盐胁迫会导致植物细胞钠离子（Na⁺）失衡，产生离子毒害；而铜（Cu）作为必需微量元素，过量则会产生毒性，抑制植物生长。红树林植物，尤其是秋茄（Kandelia obovata），因其长期生长于海陆交界的潮间带高盐、周期性淹水及可能受重金属污染的环境中，进化出了独特的耐盐和耐重金属机制。盐过度敏感1（Salt Overly Sensitive 1, SOS1）蛋白是植物SOS信号通路中的关键组分，作为质膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，负责将细胞质内过多的Na⁺排出到细胞外或运输至木质部，对于维持植物体内的钠离子稳态和耐盐性至关重要。然而，尽管SOS1基因在拟南芥、马铃薯、小麦等多种植物中已被广泛研究，但在秋茄这一典型红树林物种中，SOS1基因家族的组成、进化特征及其在盐胁迫和铜胁迫下的表达模式尚属未知。因此，本研究旨在：（1）首次在秋茄全基因组范围内系统鉴定SOS1基因家族成员；（2）对这些基因进行全面的生物信息学分析，包括理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构、保守基序、顺式作用元件、共线性和复制事件等；（3）通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析筛选出的部分SOS1基因在不同浓度盐胁迫和铜胁迫下的表达变化，探究其响应模式。这为深入理解秋茄适应高盐与重金属环境的分子基础提供了重要理论框架，也为未来利用相关基因进行作物抗逆性改良奠定了基础。
研究流程主要分为生物信息学分析和实验验证两大部分，共包含多个详细步骤。
第一部分：生物信息学鉴定与分析 研究材料与规模：以秋茄的全基因组序列（来源于NCBI数据库，项目编号PRJCA002330/GWHACBH00000000）作为研究对象，系统挖掘所有潜在的SOS1基因。 方法细节： 1. 基因鉴定与验证：利用已知的SOS1蛋白序列（如来自拟南芥的AtSOS1）作为查询序列，对秋茄蛋白质数据库进行BLASTP比对。初步获得的候选序列，进一步使用NCBI的保守结构域数据库（CDD）和Pfam数据库进行验证，确保其含有SOS1蛋白特有的Na⁺/H⁺交换器（NHX）结构域。最终，成功鉴定出20个秋茄SOS1（KoSOS1）基因。 2. 理化性质分析：使用ExPASy的ProtParam工具对20个KoSOS1蛋白进行基本特性分析，包括氨基酸数目、分子量、理论等电点（pI）、不稳定指数、脂肪族指数和平均亲水性（GRAVY）等。 3. 染色体定位与分布：根据基因在秋茄基因组注释文件中的位置信息，使用MapGene2Chromosome（MG2C）在线工具将20个KoSOS1基因可视化定位到对应的染色体上，并观察其分布特征。 4. 系统进化分析：为了解KoSOS1s与其他植物SOS1蛋白的亲缘关系，从多个物种（包括拟南芥、水稻、小麦、马铃薯、木榄）中收集了共44个SOS1蛋白序列。使用MEGA11软件，采用邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建系统进化树，并设置1000次重复进行自举检验以评估分支可靠性。 5. 基因结构与保守基序分析：利用GSDS在线工具分析KoSOS1基因的外显子-内含子结构。同时，使用MEME在线工具对KoSOS1蛋白序列进行保守基序（motif）搜索与分析，设置最大基序数为10。这两部分结果均与系统进化树进行整合，以观察同一进化分支内基因结构的保守性。 6. 蛋白质结构与亚细胞定位预测：使用SWISS-MODEL对KoSOS1蛋白进行三维同源建模，以了解其空间结构。使用SOPMA预测二级结构。通过SOSUI工具预测跨膜结构域。利用ProtComp 9.0和CELLO在线工具预测蛋白质的亚细胞定位。 7. 启动子顺式作用元件分析：提取每个KoSOS1基因起始密码子上游2000 bp的序列，提交至PlantCARE数据库进行分析，鉴定与激素响应、非生物胁迫响应、生长发育等相关的顺式作用元件。 8. 共线性与复制事件分析：使用TBtools软件，在秋茄基因组内部以及秋茄与拟南芥、毛果杨、水稻、葡萄等物种的基因组之间进行共线性分析，绘制Circos图以展示SOS1基因的共线性关系。同时，分析秋茄基因组内KoSOS1基因对的复制类型（如片段复制、串联复制）。使用KaKs_Calculator 2.0计算重复基因对的非同义替换率（Ka）、同义替换率（Ks）及其比值（Ka/Ks），以推断其进化过程中所受的选择压力。
第二部分：实验验证（基因表达分析） 研究材料与处理：实验材料为一年生秋茄幼苗。设置两种胁迫处理：（a）盐胁迫：使用当地海水和添加海盐调节，设置五个盐度梯度：S5%（对照组）、S10%、S15%、S20%、S25%；（b）铜胁迫：使用CuCl₂溶液处理，设置五个浓度梯度：Cu0 mg/L（对照组，即当地海水）、Cu50、Cu100、Cu200、Cu400 mg/L。每个处理设置3个生物学重复，每个重复包含10-12株幼苗。胁迫处理持续两年（2017年11月至2019年11月）。 方法细节：在两年处理期结束后，采集各处理组秋茄幼苗的叶片样品。使用TRIzol法提取总RNA，并反转录为cDNA。从已鉴定的20个KoSOS1基因中，随机选择了7个基因（KoSOS1009038, KoSOS1000168, KoSOS1014977, KoSOS1006610, KoSOS1004234, KoSOS1000949, KoSOS1003751）进行qRT-PCR表达分析。以秋茄的肌动蛋白（Actin）基因作为内参基因，使用2^(-ΔΔCt)法计算相对表达量。使用SPSS进行单因素方差分析（ANOVA），并用LSD检验进行多重比较（p<0.05）。使用GraphPad Prism绘制表达量柱状图。
本研究取得了多方面的系统性结果。
在基因鉴定与特征分析方面，从秋茄基因组中共鉴定出20个SOS1基因（KoSOS1s），数量远多于之前报道的结球芥菜（9个）。这20个基因编码的蛋白质长度差异较大，从466个氨基酸（KoSOS1007616）到1221个氨基酸（KoSOS1014074）不等，平均长度735.8。分子量介于51.43至131.93 kDa之间。等电点（pI）范围较广（5.07-9.58），表明这些蛋白质在不同pH环境下可能具有不同的电荷特性。亚细胞定位预测显示，大部分KoSOS1蛋白定位于质膜，这与SOS1蛋白的核心功能（将Na⁺排出细胞）相符。此外，部分蛋白也预测定位于液泡、高尔基体、内质网等细胞器，提示SOS1家族成员可能存在功能分化。
在染色体分布方面，20个KoSOS1基因不均匀地分布在秋茄18条染色体中的11条上。其中，3号染色体（chr3）包含的基因最多（4个），5号染色体有3个，1、2、7、12号染色体各有2个，其余6、10、11、13、14号染色体各1个。这种不均匀分布暗示了基因复制事件在SOS1基因家族扩张中的重要作用。
在系统进化与结构分析方面，基于秋茄与其他5种植物共44个SOS1蛋白构建的系统进化树显示，所有SOS1蛋白可分为4个主要进化枝（Group 1-4）。秋茄的20个KoSOS1蛋白分散在这4个组中，其中Group 1成员最多（8个），且与小麦、拟南芥、马铃薯的部分SOS1蛋白亲缘关系较近。基因结构分析显示，KoSOS1基因的外显子数目在3到23之间变化，内含子数目在0到6之间，表现出一定的多样性。保守基序分析鉴定出10个保守基序，同一进化枝内的成员通常具有相似或相同的基序组成，支持了进化分组的可靠性。蛋白质结构域分析证实所有KoSOS1蛋白均含有Na⁺/H⁺交换器（NHX）结构域，部分蛋白还预测含有PLSC、TrkA、CNMP等与离子转运或信号传导相关的跨膜结构域。
在顺式作用元件分析方面，对20个KoSOS1基因启动子区域的分析发现了大量与非生物胁迫响应和激素响应相关的元件。主要包括：脱落酸响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif）、乙烯响应元件（ERE）、生长素响应元件（AuxRR-core）、赤霉素响应元件（GARE-motif）等激素相关元件；以及参与干旱、低温、厌氧、防御和胁迫反应的元件，如MBS（MYB结合位点，参与干旱诱导）、LTR（低温响应元件）、ARE（厌氧诱导必需元件）、TC-rich repeats（防御和胁迫响应元件）、STRE（胁迫响应元件）等。这些丰富的调控元件预示着KoSOS1基因的表达可能受到多种环境信号和植物激素的精密调控。
在共线性与进化分析方面，共线性分析表明，秋茄与拟南芥、毛果杨、水稻、葡萄等物种的基因组之间存在大量SOS1基因的直系同源关系，说明该基因家族在植物进化过程中相对保守。在秋茄基因组内部，共识别出5对由片段复制（segmental duplication）事件产生的KoSOS1基因对（如KoSOS1000168/KoSOS1007241）。对这些重复基因对的Ka/Ks比值计算结果显示，其值分布在0.79至1.56之间。其中三对基因的Ka/Ks比值接近1（如0.88、0.79、1.03），表明这些基因在进化过程中可能经历了纯化选择或中性进化；而另外两对基因的Ka/Ks比值大于1（1.21和1.56），提示其可能经历了正选择，这可能与秋茄适应特殊高盐环境过程中新功能的获得或快速进化有关。
在基因表达模式方面，qRT-PCR分析揭示了7个选定KoSOS1基因对盐胁迫和铜胁迫的复杂响应模式。在盐胁迫下：大部分基因的表达表现出先上调后下调或直接下调的趋势。例如，KoSOS1009038在S20%时显著上调，在S25%时显著下调；KoSOS1014977在S20%时上调，在S25%时下调。值得注意的是，KoSOS1000949在所有盐胁迫浓度下（S10%-S25%）均表现为显著下调。在铜胁迫下：响应模式与盐胁迫有所不同，部分基因表现出持续上调。例如，KoSOS1004234和KoSOS1000949在Cu50至Cu400的所有浓度下均显著上调；KoSOS1006610在Cu100、Cu200、Cu400时显著上调。而KoSOS1009038在铜胁迫下的表达变化则呈现波动。这些差异化的表达谱表明，不同的KoSOS1基因可能在秋茄应对不同类型（离子毒性 vs. 氧化/重金属毒性）和不同程度胁迫时发挥着各自特定的、精细化的调控功能。一个有趣的对比是，KoSOS1000949在盐胁迫下持续下调，在铜胁迫下却持续上调，这可能反映了该基因在秋茄应对不同胁迫策略中的独特角色。
基于以上结果，本研究得出以下结论：首次在红树林植物秋茄的全基因组范围内系统鉴定并表征了由20个成员组成的SOS1基因家族。该家族在进化上可分为4个主要分支，其扩张主要受片段复制事件驱动，部分基因对显示出正选择迹象。KoSOS1基因具有多样化的基因结构和丰富的启动子顺式作用元件，预示着其表达调控的复杂性。表达分析证实，多个KoSOS1基因能够响应盐和铜胁迫，但其表达模式存在基因特异性和胁迫类型特异性。这些发现为理解秋茄适应潮间带高盐和潜在重金属污染环境的分子机制提供了关键线索。
本研究的价值在于：科学价值：填补了红树林植物SOS1基因家族研究的空白，首次揭示了秋茄SOS1基因家族的全景，包括其数量、进化历史、结构特征和胁迫响应模式，丰富了植物耐盐和耐重金属分子机制的知识体系，特别是关于木本植物如何通过基因家族扩张和分化来适应极端环境。应用价值：鉴定出的响应盐/铜胁迫的关键KoSOS1基因（如持续上调或具有特定响应模式的基因），可作为未来作物抗逆（耐盐、耐重金属）遗传改良的候选基因资源。通过基因工程手段（如CRISPR/Cas基因编辑或过表达）将这些基因导入农作物，有望培育出能在边际土地上（如盐碱地、轻度污染土壤）生长的作物新品种，对于保障粮食安全和生态修复具有重要意义。
本研究的亮点包括：1. 开创性：这是首篇对红树林植物秋茄SOS1基因家族进行全基因组水平系统鉴定和深入分析的论文，研究对象具有独特生态适应性。2. 系统性：研究结合了全面的生物信息学分析（从序列到进化，从结构到调控）和严谨的实验验证（长达两年的田间模拟胁迫处理及qRT-PCR验证），形成了一个完整的研究闭环。3. 发现的新颖性：揭示了KoSOS1基因家族在秋茄中的规模（20个）远大于一些已报道的作物；发现了部分基因对可能经历正选择；首次报道了秋茄SOS1基因对铜胁迫的响应，并观察到与盐胁迫不同的表达模式，特别是KoSOS1000949基因的相反响应趋势，为后续功能研究提供了重要方向。4. 方法的规范性：采用了标准的基因组学、生物信息学和分子生物学研究方法，数据分析详实，图表清晰，结论可靠。
此外，本研究提供的详细数据（如20个KoSOS1基因的完整信息表、系统进化树、表达谱等）为其他研究者进行相关比较基因组学或功能基因组学研究提供了宝贵的基础数据。论文中关于长期（两年）胁迫处理的设计，也更能模拟红树林在自然环境中经受的持续胁迫，使得表达分析结果更具有生态生理学意义。