本研究由安徽农业大学的Yifan Chen、Ning Yi等学者团队完成，发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》期刊（2021年8月），题为”CsHCT-mediated lignin synthesis pathway involved in the response of tea plants to biotic and abiotic stresses”。研究聚焦茶树（Camellia sinensis）在应对生物与非生物胁迫时，苯丙烷代谢途径中木质素与黄酮类化合物合成的调控机制，特别是羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase, HCT）的关键作用。

学术背景

茶树作为重要经济作物，其次生代谢产物（如黄酮类和木质素）与抗逆性和茶叶品质密切相关。前人研究表明，苯丙烷代谢途径是木质素和黄酮类合成的共同通路，其中HCT位于代谢分支点，可能调控碳流向。然而，茶树中HCT如何协调这两条通路以响应胁迫尚不明确。本研究旨在：（1）鉴定茶树HCT基因（CsHCTs）；（2）解析其酶学特性；（3）验证其在代谢流重分配和抗逆性中的作用。

研究流程与方法

1. 基因表达谱分析

通过公共转录组数据库（Tea Plant Information Archive）和团队自有数据，分析了茶树在不同胁迫（低温、盐、干旱、遮荫、蔗糖、茉莉酸甲酯）下苯丙烷、木质素和黄酮途径基因的表达模式。样本包括不同发育阶段的叶片，通过qRT-PCR验证关键基因表达。

2. CsHCTs基因克隆与系统发育分析

从茶树品种”舒茶早”中克隆CsHCT1和CsHCT2基因（GenBank登录号见附表），使用DNAMAN和MEGA 6.0进行多序列比对及系统发育树构建（邻接法，Bootstrap检验1000次）。发现茶树23个BAHD家族基因中，CsHCTs在四种胁迫下均上调表达。

3. 蛋白异源表达与酶学特性

将CsHCTs和Cs4CL（4-香豆酰辅酶A连接酶）基因连接至pRSFDuet-1载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化His标签蛋白。建立双酶反应体系（含咖啡酸/香豆酸、莽草酸/奎宁酸、ATP等），通过HPLC和Q-TOF-LC/MS鉴定产物。优化反应条件（pH 4.0-5.0，35℃），测定动力学参数（Km、Vmax）。

4. 转基因功能验证

构建35S启动子驱动的CsHCTs过表达载体，通过农杆菌介导转化烟草（Nicotiana benthamiana）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）。检测转基因植株中： - 酚酸（如绿原酸5-CQA）和木质素含量（乙酰溴法） - 黄酮醇苷类含量（UPLC-QQQ-MS/MS） - 抗逆表型（干旱、盐、冷、病原菌接种）

5. 组织特异性分析

测定茶树不同器官（嫩芽、茎、根）中酚酸衍生物含量与CsHCTs表达相关性，通过亚细胞定位（GFP标记）确定蛋白分布。

主要结果

1. 胁迫响应模式：非生物胁迫（除蔗糖外）上调木质素途径基因（如PAL、C3’H）而抑制黄酮途径基因（如CHS、DFR），茉莉酸甲酯（MeJA）处理同时激活两条通路但木质素通路更强（图2）。

2. 酶学特性：CsHCTs能以莽草酸（shikimate, SA）和奎宁酸（quinate, QA）为底物，催化生成5-咖啡酰奎宁酸（5-CQA）和5-O-咖啡酰莽草酸（5-O-CSA）。动力学分析显示其对SA的亲和力更高（Km=14.2±1.8 μM，kcat/Km=2.31×10^4 M^-1s^-1）（图5）。

3. 代谢流重分配：

   • 过表达CsHCTs的烟草中，木质素含量提高1.1-2倍，5-CQA增加而黄酮醇苷减少（图7）。
   • 拟南芥转基因株系表现出更强的抗旱性（主根长增加35%）（图8d）。

4. 抗性机制：CsHCTs通过将碳源从黄酮途径转向绿原酸和木质素合成，增强细胞壁强化和抗氧化防御。转基因烟草对农杆菌侵染的抗性显著提高（FV/FM值比对照高20%）（图7e）。

结论与价值

本研究首次阐明： 1. 科学价值：揭示茶树通过HCT动态调控苯丙烷代谢流以应对胁迫的分子机制，提出”碳源竞争模型”——胁迫下碳优先流向木质素合成以强化细胞壁。 2. 应用价值：为培育抗逆茶树品种提供靶基因（CsHCTs），同时提示可通过调控HCT活性平衡茶叶品质（降低苦涩味）与抗性。 3. 创新点： - 开发双酶反应体系解决酰基-CoA底物不稳定的技术难题 - 发现茶树HCT兼具HCT和HQT（羟基肉桂酰奎宁酸转移酶）双重功能 - 建立”抗性-品质”协同调控新策略

研究亮点

1. 多组学整合：结合转录组、代谢组和转基因验证，系统解析CsHCTs功能。
2. 酶学创新：明确CsHCTs对SA/QA的底物偏好性，为定向改造提供依据。
3. 跨物种验证：在烟草和拟南芥中均证实CsHCTs的抗逆功能，增强结论普适性。

补充发现

• 茶树茎中酚酸衍生物以4-位异构体为主（如4-CQA），而叶片以5-位为主，可能与组织pH差异有关（图6d）。
• 木质素含量与CsHCTs表达呈正相关（R²=0.82），可作为抗性标记物（图6e）。

（注：文中涉及的实验细节如引物序列、质粒构建等可参考原文附表及补充材料）