学术研究报告：基于亚甲蓝氧化还原化学的光学方法用于多相生物反应器局部氧限制的可视化研究
本研究由来自德国汉堡工业大学的Ryan Rautenbach、Katharina Zörner、Marko Hoffmann、Michael Schlüter以及斯图加特大学的Jonas Barczyk、Ralf Takors共同完成，并于2026年发表在学术期刊《Biotechnology and Bioengineering》上。
一、 学术背景
本研究属于生化工程与多相流反应工程交叉领域，聚焦于好氧生物过程的核心挑战之一：空间氧限制。在气液搅拌釜反应器（STR）中，溶解氧（DO）的可用性受流体动力学和传质过程的共同支配，导致其空间分布本质上是非均匀的。这种不均匀性会引发细胞生理应激、代谢异质性，并最终影响生物过程的性能、稳健性和可放大性。因此，识别和表征反应器内的氧限制区域对于理解流体动力学-生物相互作用、设计具有代表性的缩小规模系统以及验证计算流体动力学（CFD）模型至关重要。
然而，传统实验技术难以获取空间连续的氧供应信息。常规的电化学或光学DO探头虽能提供精确的局部测量，但本质上是点式且侵入式的，空间覆盖稀疏。CFD模拟可以预测氧浓度场，但其验证因缺乏实验可获取的空间连续参考数据而受限。其他技术，如流动跟随传感器或基于荧光/磷光的氧成像技术，则在空间分辨率、设备复杂性或适用于实际搅拌釜条件方面存在局限。此外，广泛用于空间混合特性表征的示踪剂注入法（如酸碱体系），其观测到的空间模式强烈依赖于示踪剂的注入位置和初始输运路径，可能无法直接反映与气液传质相关的本征氧供应特性。
在此背景下，本研究旨在开发一种简单、低成本、非侵入式且能提供空间连续信息的光学方法，以可视化搅拌釜生物反应器中的局部氧供应限制。该方法基于亚甲蓝（Methylene Blue, MB）在碱性葡萄糖溶液中的可逆氧化还原化学，通过记录反应器从完全还原（无色）状态在曝氧条件下重新被氧化的空间过程，获得二维的着色时间场，从而定性地揭示由流体动力学输运和气液传质主导的局部氧供应情况。
二、 详细研究流程
本研究主要包含两大阶段：1）反应介质配方的系统筛选与优化；2）在选定介质下，应用该方法研究不同搅拌速度对氧供应空间分布的影响。所有实验均在一个实验室规模的双层搅拌桨玻璃反应器（总容积3.2 L，工作体积2.7 L）中进行，反应器置于恒温（21°C）水浴中以减少光学畸变。
第一阶段：反应介质配方的确定 研究首先系统评估了葡萄糖和氢氧化钠（NaOH）浓度对MB氧化还原系统稳定性和重现性的影响，以筛选出适用于光学测量的稳健反应介质。 * 研究对象与处理：反应介质由去离子水、1% MB水溶液（2 mL）、不同浓度的NaOH和葡萄糖组成。实验分为两组：a) 固定NaOH浓度为0.200 mol L⁻¹，变化葡萄糖浓度（75, 100, 125, 150, 175 g L⁻¹）；b) 固定葡萄糖浓度为100 g L⁻¹，变化NaOH浓度（0.100, 0.150, 0.175, 0.200, 0.250 mol L⁻¹）。每组条件均在恒定的曝氧速率（40 L h⁻¹）和搅拌速度（160 rpm）下进行重复实验（葡萄糖组7次，NaOH组5次）。 * 实验方法与数据分析：每个实验的流程标准化。首先，通过向反应器中通入氮气进行吹扫，将整个反应体系驱动至完全还原（无色）状态，并通过光学DO探头监测确认DO降至低平台。停止氮气后，让反应器在单相（仅液体）搅拌条件下平衡约2分钟，然后开启纯氧曝气（定义为时间零点）。使用尼康D7500相机以60 fps的帧率正交记录反应器从无色到蓝色（氧化态）的整个空间着色过程。图像处理采用Fitschen等人开发的像素级评估策略：对每个像素的灰度值轨迹进行归一化处理，将局部着色时间（t_col(x, y)）定义为该像素灰度值达到其最终氧化态灰度值95%的最早时间。全局着色时间则定义为95%的像素达到阈值的时间。此阶段主要关注全局着色时间，以评估介质配方的稳定性和重现性。
第二阶段：局部氧供应的空间表征 在确定了最佳介质配方（0.20 mol L⁻¹ NaOH， 175 g L⁻¹ 葡萄糖）后，研究将其应用于考察搅拌速度对氧供应空间分布的影响。 * 研究对象与处理：在选定的介质中，考察了0, 60, 160, 260, 360, 460 rpm共六个搅拌速度下的氧供应情况。这些条件代表了与哺乳动物细胞培养过程相关的温和曝气操作窗口。 * 实验方法与数据分析：实验流程与第一阶段类似，包括氮气吹扫还原、单相平衡和纯氧曝气启动。使用相同的相机设置记录着色过程。除了计算全局着色时间，重点在于获取并分析二维的局部着色时间场（t_col(x, y)）。为了验证氧化步骤（由氧驱动）远快于竞争性的还原步骤（由葡萄糖驱动）这一关键假设，研究还额外进行了反向实验：在完成正向着色实验后，停止氧曝气（保持搅拌或不搅拌），记录系统仅通过化学还原途径从蓝色完全褪回无色所需的时间（全局褪色时间，t_red），并与着色时间进行对比。 * 数据处理与可视化：所有局部着色时间场通过像素级分析获得。为了在不同搅拌速度下清晰显示空间梯度，将低速（0-160 rpm）和高速（260-460 rpm）的着色时间场分别用不同的颜色标尺进行可视化，因为高搅拌下整体着色更快，需要更窄的时间尺度来显示细节。
三、 主要研究结果
1. 反应介质配方的筛选结果： * 葡萄糖浓度影响：在75至175 g L⁻¹的范围内，一旦葡萄糖过量（> ~75 g L⁻¹），其浓度对全局着色时间（21-24秒）没有显著影响。这表明葡萄糖主要作为还原剂储备，决定了系统可进行氧化还原循环的“寿命”，但不影响氧驱动的着色过程的时间尺度，因为氧化步骤是传质限制的。 * NaOH浓度影响：NaOH浓度对系统的稳定性和重现性影响显著。在较低浓度（0.100–0.175 mol L⁻¹）下，还原反应较慢且不稳定，导致着色时间变异性大。在较高浓度（0.20–0.25 mol L⁻¹）下，系统变得稳定且重现性好，还原步骤均匀进行但又不至于过度抑制氧化。浓度过高（>0.25 mol L⁻¹）则可能导致还原反应占主导，使氧化无法发生。因此，选择0.20 mol L⁻¹ NaOH作为最佳浓度，能在保证氧化步骤对氧传输敏感的前提下，提供稳定可靠的响应。
2. 反向还原反应验证结果： 在停止曝氧的条件下，仅通过化学还原使体系从蓝色褪至无色所需的时间（t_red）远长于氧驱动的着色时间。在0 rpm和460 rpm下，t_red分别为1018±35秒和911±24秒（约17-15分钟），比所有操作点下观测到的着色时间（秒级）高出一个数量级以上。这证实了在所选介质条件下，竞争性的葡萄糖还原途径足够慢，不会主导或干扰着色实验期间测量的局部或全局着色时间，从而保证了着色模式主要反映氧的输运过程。
3. 局部氧供应空间表征结果： * 全局趋势：全局着色时间（t_col）随搅拌速度增加而单调递减，在较高转速下递减趋势趋于平缓。这与湍流增强促进整体氧传输的预期一致，表明该方法能有效响应流体动力学强度的变化。 * 空间分布模式：局部着色时间场揭示了不同搅拌强度下特征性的氧限制空间结构。 * 0 rpm：仅由上升气泡驱动循环，导致在分布器上方形成狭窄的快速氧化羽流，而周围主体区域则存在大范围的缓慢再氧化区，呈现出强烈的径向梯度。 * 60 rpm：搅拌桨诱导的循环开始重新分布气体羽流，减少了缓慢再氧化区的范围，但在壁面和底部角落仍存在明显的缓慢供氧区域。搅拌桨之间的区域则因更强的传质而受益。 * 160 & 260 rpm：随着流动变得更加湍流，缓慢氧化区域逐渐缩小，表明溶解氧的供应更加均匀。 * 360 & 460 rpm：再氧化过程快速且在整个液体体积中几乎均匀。剩余的梯度主要集中在近壁区域，这是由于边界层效应和较弱的径向交换限制了局部氧的补充。这表明在强搅拌条件下，着色场主要突出了固体边界附近的残余传输限制，而非整体的氧传递限制。
四、 研究结论与意义
本研究成功开发并验证了一种基于亚甲蓝可逆氧化还原化学的光学方法，用于可视化和识别气液搅拌釜生物反应器中的局部氧限制。通过将反应器驱动至均匀还原状态并监测其空间再氧化过程，该方法能生成反映由流体动力学输运和气液传质主导的局部氧供应的二维着色时间场。
科学价值与应用价值： 1. 提供了一种新颖的空间表征工具：该方法填补了点式DO探头（空间信息稀疏）和复杂激光成像技术（设备要求高）之间的空白，提供了一种简单、低成本、易于实施的空间连续氧供应可视化手段。 2. 揭示了流体动力学与氧供应的直接关联：实验获得的着色时间场直观地展示了不同搅拌条件下反应器内氧供应的空间异质性，如弱搅拌下的大范围供应不足区、随湍流增强的逐渐均一化过程以及高搅拌下近壁区的残余传输限制。这些模式与搅拌釜已知的流体动力学特征一致。 3. 具有互补性：与依赖于局部扰动（示踪剂注入）的混合时间测量方法不同，本方法基于正常的曝气操作条件，着色模式源于流体动力学与气液传质的内在相互作用，提供了与氧可用性直接相关的补充信息。 4. 支持过程开发与放大：该方法可用于识别氧限制的操作点、比较不同反应器构型、支持未来规模放大研究，并为氧传输和气液传质的CFD模型提供定性验证数据。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究在讨论部分指出了本方法的局限性及未来展望：首先，当前实验在去离子水中进行以保证条件明确，在实际生物过程中，培养基成分、生物质的存在以及粘度的增加可能会影响氧传输，因此本研究结果可视为对氧供应性能的保守估计。其次，光学测量本质上是三维流场沿光路方向的深度积分投影，可能会平滑空间梯度。未来工作可评估该方法在更复杂、更接近实际过程的介质中的适用性，并将其空间分辨率和灵敏度与成熟的激光基氧传感技术进行比较。此外，通过将亚甲蓝系统与平面激光照明等技术结合，可以减少深度积分效应，获得更高空间分辨率的截面视图，但这会增加光学设置的复杂性。该方法亦可用于支持CFD验证和代表性缩小规模反应器概念的设计。所有研究数据和后处理脚本均已公开，促进了研究的可重复性和进一步开发。