本文作者为Remy Petkantchin、Adrien Berchet、Hanchuan Peng、Henry Markram及Lida Kanari，分别隶属于瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）的Blue Brain Project，以及中国复旦大学脑与智能研究院/上海自然科学研究院。该研究于2025年7月9日在线发表于 *Nature Communications*，文章编号为2025;16:6611，DOI为10.1038/s41467-025-62030-3，属于原创性研究方法学论文。

学术背景

该研究属于计算神经科学领域，聚焦于脑内长程轴突（long-range axons, LRAs）的合成及其在大规模脑连接组构建中的应用。脑连接组研究通常面临两个尺度间的断层：局部脑区内的连接可通过电子显微镜重建获取精细数据，而脑区之间的长程连接则主要依赖MRI等宏观成像技术，难以在单细胞分辨率上实现全脑覆盖。已有大量算法能够合成树突形态，但轴突跨越多个脑区、延伸距离远、靶向模式复杂，其合成难度显著更高。此前作者团队提出的ROOTS模型虽可生成齿状回内的轴突形态，但仅限于单一脑区，无法推广至多脑区投射的长程轴突。研究团队在前期工作中已开发出一种基于终端点连接的长程轴突合成算法，可较为准确地再现重建轴突的形态学特性，但尚未解决轴突靶向脑区的泛化问题。本研究旨在建立一套完整流程，从稀疏实验数据出发，生成全脑范围的长程轴突，并进一步建立单细胞分辨率的全脑连接组，弥合连接组（connectome）与投射组（projectome）之间的鸿沟。

研究流程

整体工作流程包含四个主要步骤：输入数据处理与投射分析、高斯混合模型（Gaussian Mixture Model, GMM）聚类、长程轴突合成、以及连接计算与验证。

首先，研究团队整合了三个来源的小鼠脑轴突形态学数据：来自Janelia MouseLight项目的1084个形态数据、来自Peng等人2021年发表的1741个形态数据、以及通过与中国东南大学及Hanchuan Peng合作获得的800个未发表数据（所用实验协议与Peng等人2021年一致）。原始数据经过morphology-workflows软件的修复处理，剔除重建不完整或存在伪影的样本后，共计3601个形态数据用于后续分析。所有形态数据均被配准到Allen Brain Atlas的增强版本——即Bolaños-Puchet等人2023年提出的包含层坐标系统与桶状皮层注释的小鼠脑图谱中。对每一根轴突，计算其在各个脑区内的终端点数量与轴突路径长度，作为投射特征向量。

在聚类环节，研究采用无监督GMM对来源于同一脑区的轴突按投射模式进行分组。GMM假设每个聚类服从多元正态分布，通过期望最大化（Expectation-Maximization, EM）算法优化参数，并使用贝叶斯信息准则（Bayesian Information Criterion, BIC）自动选择聚类数目。对于前下托（presubiculum）的59个轴突，作者设定5个聚类以对应Wheeler等人2023年报道的层级聚类结果，验证了基于轴突长度和基于终端数两种特征在聚类上具有等价性，二者在目标脑区内呈线性关系。

在合成阶段，作者首先在等皮质（isocortex）内合成了包含胞体、树突及移植局部轴突的神经元形态。对于锥体细胞，局部轴突被替换为合成LRAs。每个待合成神经元的胞体作为源点，依据GMM聚类按概率密度分配一个聚类标签。目标点的选取方式为：先根据聚类中轴突到达某脑区的比例确定目标脑区，再依据该聚类内簇（tuft）数量的均值与方差随机生成目标点，并将其随机放置于目标脑区内。随后，采用加权Steiner树算法在包含源点、目标点以及纤维束内部边缘点的图上连接这些点，并通过后处理引入局部形态学噪声与曲率修正，使合成主干（trunk）更接近生物轴突。最后，依据目标点所在组的代表度得分选择相应的tuft，并利用Kanari等人2022年发表的树突合成算法（NeuroTS）在目标点处生长tuft结构。连接的产生基于神经突分支的空间接近性检测，并经过最小bouton间距、突触密度及生理约束过滤，最终转换为突触连接。

主要结果

研究以初级运动区第5层（primary motor area layer 5, MOp5）锥体细胞为详细验证案例。从54401个等皮质合成细胞中，1695个为MOp5锥体细胞并合成了LRA。定性比较显示，合成轴突与65个生物学重建轴突在扁平图谱和三维脑图谱中呈现相似的投射路径和终止区域。

在形态计量学层面，tuft的形态特征与生物重建具有良好一致性，证明树突与轴突末端分支可用同一拓扑描述方法合成。轴突主干的形态计量也基本匹配，但在新的目标点选择策略下，合成轴突的分支数量略少、节段长度与路径距离略长、远端分叉角稍大。针对MOp各层及远端脑区（如尾壳核、初级/次级运动区、脑桥灰质、三叉神经脊束核及初级/次级体感区），合成轴突的终止比例与路径长度分布均较准确地复现了生物数据。

在靶向验证中，合成轴突在皮层下板（cortical subplate, CTXsp）、等皮质、延髓、脑桥灰质、丘脑、下丘脑、中脑、嗅区、苍白球和纹状体等区域的投射比例与生物重建非常接近。与Jiang等人2020年发表的独立MOp5轴突数据集相比，合成轴突的投射比例差异最大为脑桥灰质10.4%，其余脑区差异在5%至7%之间，表明算法对未见过的数据具有一定的泛化能力。

在连接验证中，生物LRAs与合成LRAs在等皮质各亚区的传出连接比例在统计上等效。仅含局部轴突的投射组与加入LRAs后的投射组相比，后者显著改变了脑区间连接格局。局部轴突仅能连接与MOp邻近的区域，而LRAs则能在远端区域形成大量连接。合成LRAs的出度分布与生物LRAs一致，表现为长尾分布，显著不同于局部轴突的单峰小出度分布。此外，研究还发现连接数量与轴突在脑区内的总长度成线性关系，提示可通过轴突长度预测连接数量。

在更大范围的应用中，研究对17个等皮质亚区共1472个生物轴突进行聚类，并合成了21680个LRAs。投射组分析显示运动区与体感区产生了大量传出与传入突触连接，各脑区间的互连程度远高于仅包含局部轴突的模型。

结论与价值

该研究首次实现了从稀疏轴突形态数据出发，在单细胞分辨率上生成全脑范围的长程轴突，并据此构建大规模皮层连接组。合成轴突在局部形态学、全局拓扑结构及靶向投射比例上均与实验重建统计相似，且连接结果可通过独立的实验数据进行验证。该方法仅需少量参数即可工作，且具有物种通用性，理论上可适应大鼠或人脑数据。其科学价值在于，通过数据驱动的方式让连接性质自然涌现，而非人工强加投射规则，从而弥合局部与全脑尺度连接研究的断层。在应用层面，该算法可促进全脑仿真模拟，改进MRI模拟与神经影像预测，并可能用于神经发育或退行性疾病的早期诊断及个体化药物测试。

研究亮点

本研究的核心创新在于：首先，作者利用GMM聚类捕捉轴突投射的群体性规律，解决了以往算法只能逐根模仿而无法泛化到多脑区多细胞来源的问题；其次，合成过程中引入纤维束偏好，使得主干路径更符合生物学约束；再次，tuft的选择与合成完全基于统计特性，保证了形态多样性与生物一致性。最后，该方法展示了仅用约1%的细胞密度即可构建出统计可靠的连接组，为虚拟脑实验提供了可行的技术路线。研究还通过连接数量与轴突长度的线性关系揭示了预测连接的潜在规则，为后续数据补全和全脑连接推断提供了新的思路。