该研究由空军军医大学基础医学院微生物学教研室的司悦、西京医院神经内科的张海军以及空军军医大学基础医学院微生物学教研室的周子晴（三人为并列第一作者）领衔，通讯作者为雷迎峰、张芳琳和马宏伟教授。合作单位还包括西京医院麻醉与危重医学科、西北大学生命科学与医学学院等。研究成果以题为《RIPK3 promotes hantaviral replication by restricting JAK-STAT signaling without triggering necroptosis》的论文形式，于2023年发表在期刊 Virologica Sinica 上。
研究的学术背景 本研究属于病毒学与宿主先天免疫学交叉领域，聚焦于汉坦病毒（Hantavirus）的致病机制，特别是病毒如何逃逸宿主干扰素（Interferon， IFN）系统的抗病毒反应。汉坦病毒，尤其是汉滩病毒（Hantaan virus， HTNV），是引起肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome， HFRS）的主要病原体，致死率高达15%，目前缺乏特异性疗法。干扰素及其下游的干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes， ISGs）是宿主抵御病毒感染的第一道防线。然而，一个长期困扰科学界的现象是：在HFRS重症患者体内，尽管存在高水平的干扰素，病毒复制却不受控制，病情反而加重。这表明HTNV进化出了在感染晚期逃避高水平干扰素抗病毒作用的机制，但具体机制尚不明确。
受体相互作用蛋白激酶3（Receptor-interacting protein kinase 3， RIPK3）是介导细胞坏死性凋亡（necroptosis）的关键分子。近年研究发现，RIPK3的功能超出细胞死亡范畴，可参与调控炎症和干扰素信号通路。例如，有研究报道RIPK3可促进脂多糖（LPS）诱导的IFN-β产生，而本研究团队之前的工作发现，在日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus， JEV）感染中，RIPK3通过下调特定ISG（IFI44L）的表达来促进病毒在神经元中的复制。这些看似矛盾的结果提示，RIPK3在感染中的作用可能因病原体和感染阶段而异。因此，本研究旨在探究RIPK3在HTNV感染中扮演的角色，特别是其在调节宿主干扰素应答及病毒免疫逃逸中的功能，以期揭示HTNV感染晚期干扰素应答失效的新机制。
详细的工作流程 本研究采用了从体外细胞模型到体内动物模型的系统性研究策略，结合了分子生物学、细胞生物学、病毒学和免疫学等多种技术手段，工作流程环环相扣，逻辑严密。
1. 体外细胞模型建立与初步表型观察： * 研究材料： 使用小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages， BMDMs）作为主要研究对象，因为巨噬细胞是HTNV的重要靶细胞和复制场所。同时使用人肝癌细胞（Huh-7）、人非小细胞肺癌细胞（A549）、小鼠成纤维细胞（L929）和HEK293T细胞等进行辅助实验或机制探索。 * 样本量/实验重复： 所有体外实验均至少进行三次独立生物学重复，以确保结果的可靠性和可重复性。 * 实验方法与流程： * 感染模型建立： 使用HTNV毒株76-118以不同的感染复数（MOI）感染BMDMs等细胞，并设置未感染组作为对照。 * RNA测序（RNA-seq）与通路富集分析： 对HTNV感染后的BMDMs进行RNA-seq，通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路富集分析，发现细胞死亡相关通路在感染后被激活，特别是坏死性凋亡相关基因如RIPK3表达上调。这是本研究关键的出发点。 * 细胞死亡表型验证： 通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）验证了RIPK3蛋白水平在感染后期（24-48小时）显著上调，而坏死性凋亡执行蛋白MLKL的磷酸化并未持续增加。进一步通过流式细胞术检测细胞凋亡/坏死（Annexin V/PI染色）、细胞内ATP水平测定以及细胞活力染料（Calcein AM/PI）染色，证实HTNV感染并不像JEV那样引起明显的细胞死亡。 * 坏死性凋亡诱导敏感性测试： 使用经典的坏死性凋亡诱导剂组合（TSZ：TNF-α, SMAC mimetic, zVAD-fmk）处理细胞，发现HTNV感染既不能自身诱导坏死性凋亡，也无法阻止TSZ诱导的细胞死亡。这表明HTNV激活的RIPK3并未执行传统的促死亡功能。
2. RIPK3功能鉴定与干扰素信号通路关联分析： * 研究方法： * 基因敲低与敲除： 使用小干扰RNA（siRNA）在BMDMs中敲低RIPK3、MLKL或ZBP1，或直接使用从RIPK3基因敲除（RIPK3-/-）小鼠分离的BMDMs进行实验。 * 基因过表达： 构建RIPK3及其突变体质粒（如激酶失活突变体K51A、D161N，以及结构域缺失突变体δPKD、δRHIM），转染细胞。 * 病毒复制评估： 通过Western blot检测HTNV核蛋白（NP）的表达，通过qRT-PCR绝对定量检测HTNV S基因片段（编码NP）的拷贝数，以评估病毒复制水平。 * 核心发现流程： * 敲低或敲除RIPK3显著抑制了HTNV的复制（NP蛋白和病毒RNA减少），而过表达RIPK3则促进病毒复制。 * 对WT和RIPK3-/- BMDMs感染HTNV后进行RNA-seq，分析差异表达基因。结果显示，RIPK3缺失导致大量ISGs（如MX1， MX2， ISG15）和促炎细胞因子基因显著上调。KEGG富集分析显示，JAK-STAT信号通路在RIPK3-/-组中被显著激活。 * 通过双荧光素酶报告基因实验，发现过表达RIPK3能特异性抑制由poly(I:C)刺激激活的STAT1和ISRE（干扰素刺激应答元件）报告基因活性，但不影响IFN启动子本身的活性。这表明RIPK3作用于JAK-STAT通路的下游，干扰素产生之后。 * 通过Western blot检测JAK-STAT通路关键蛋白，发现RIPK3缺失促进了STAT1蛋白的表达及其在Ser727位点的磷酸化激活；反之，过表达RIPK3则抑制STAT1的磷酸化。而JAK2的激活不受影响。这直接证明了RIPK3通过抑制STAT1的激活来阻断干扰素信号的传导。 * 进一步的qRT-PCR证实，RIPK3缺失导致多个关键ISGs（如MX1， IFIT1， IFIT2， ISG15）的表达增强，而过表达RIPK3则抑制这些基因的表达。同时，ELISA检测发现RIPK3的缺失或过表达并不影响I型干扰素（IFN-α/β）的分泌水平。这完美解释了现象：RIPK3不干扰干扰素的产生，但阻断了干扰素信号向下游ISGs的传递。
3. RIPK3抑制STAT1的分子机制探究： * 研究方法： 免疫荧光共定位、免疫共沉淀（Co-IP）、分子对接模拟、点突变和截短体构建。 * 工作流程与发现： * 亚细胞定位： 免疫荧光显示，在HTNV感染或过表达RIPK3的细胞中，STAT1被从细胞质“募集”到核周区域，并与RIPK3发生共定位。 * 蛋白相互作用验证： Co-IP实验证实，外源表达的RIPK3与STAT1能够相互结合。更重要的是，内源性Co-IP显示，HTNV感染增强了RIPK3与STAT1之间的相互作用。 * 相互作用结构域鉴定： 通过生物信息学分子对接模拟预测了RIPK3与STAT1可能的相互作用界面。构建RIPK3的截短突变体（缺失蛋白激酶结构域PKD的δPKD， 缺失RHIM结构域的δRHIM）进行Co-IP，发现缺失PKD会破坏RIPK3与STAT1的结合，而缺失RHIM则不影响。这表明RIPK3通过其蛋白激酶结构域（PKD） 与STAT1相互作用。 * 激酶活性非依赖性： 构建激酶活性丧失的RIPK3点突变体（K51A， D161N）并过表达，发现这些激酶失活的突变体依然能够抑制STAT1的磷酸化并促进HTNV复制。这表明RIPK3对STAT1的抑制不依赖于其激酶活性，而更可能是通过PKD与STAT1结合产生空间位阻或将其“扣押”在细胞质中，阻止其正常激活和核转位。
4. 体内动物模型验证： * 研究材料： 使用野生型（WT）C57BL/6J小鼠和RIPK3-/- C57BL/6J小鼠（6-8周龄，雌性）。 * 样本量： 每组小鼠数量未在摘录中明确给出，但研究进行了全面的表型、病理和分子检测。 * 实验流程： * 病毒感染与临床评估： 通过静脉注射途径用HTNV感染小鼠。每日监测小鼠体重、肛温（核心温度）和体表温度，并采用小鼠败血症评分（MSS）系统评估疾病严重程度。 * 血液学与生化分析： 感染后第9天，采集血液进行血常规（如血小板、中性粒细胞、淋巴细胞计数）和肝肾功能生化指标检测。 * 病毒载量与组织病理学分析： 处死小鼠，收集血清通过qRT-PCR绝对定量检测病毒RNA拷贝数。采集肺、脾、肾等主要器官，进行： * Western blot和免疫荧光： 检测器官中HTNV NP蛋白表达、STAT1/p-STAT1蛋白水平以及巨噬细胞标记物F4/80的浸润情况。 * 苏木精-伊红（H&E）染色： 观察组织病理损伤。 * 透射电镜（TEM）： 观察肺组织超微结构变化。
主要研究结果 1. HTNV感染特异性上调RIPK3表达但不引发细胞死亡。 RNA-seq和qRT-PCR数据显示，HTNV感染后期（24-48小时），坏死性凋亡相关基因，特别是RIPK3的mRNA和蛋白水平显著上调，而MLKL的激活是短暂且不持续的。多种细胞死亡检测方法（ATP检测、Annexin V/PI流式、Calcein/PI染色）均证实，HTNV感染本身不引起BMDMs死亡，也无法抵抗外源性坏死性凋亡诱导剂（TSZ）的作用。这首次明确了在HTNV感染背景下，RIPK3被激活但执行非死亡功能。
2. RIPK3是促进HTNV复制的关键宿主因子，其机制是通过抑制JAK-STAT信号通路。 功能丧失（敲低/敲除）和功能获得（过表达）实验一致证明，RIPK3正向调控HTNV的复制。深入的机制研究发现： * RIPK3的缺失导致感染细胞中ISGs和促炎因子基因的广泛上调，而过表达RIPK3则产生相反效果。 * 报告基因和蛋白检测锁定RIPK3的作用靶点是STAT1的磷酸化激活步骤，而非上游的干扰素产生或JAK2激活。 * RIPK3缺失并不影响模式识别受体（如TLR3， TLR4）的表达和I型干扰素的分泌。这完整地描绘出一条清晰的信号干扰路径：HTNV → 激活RIPK3 → RIPK3抑制STAT1磷酸化 → ISGs表达受阻 → 病毒复制增强。
3. RIPK3通过其蛋白激酶结构域与STAT1直接互作，并以激酶活性非依赖的方式抑制STAT1。 这是本研究在分子机制上的核心发现。免疫荧光和Co-IP实验提供了RIPK3与STAT1存在直接相互作用的直接证据，且这种相互作用在HTNV感染后增强。通过构建一系列突变体，研究精确地定位出负责这一相互作用的功能域是RIPK3的PKD。最有趣的是，即使RIPK3失去激酶活性（K51A， D161N突变），它依然能结合并抑制STAT1的激活。这揭示了RIPK3一种全新的、不依赖于其经典激酶活性的功能模式，即作为STAT1的“分子诱饵”或“空间阻碍器”。
4. 在体内，RIPK3缺失增强了宿主抗病毒免疫，加速了病毒清除，并减轻了病理损伤。 动物实验完美验证了体外发现的生理意义。与WT小鼠相比，感染HTNV的RIPK3-/-小鼠表现出： * 更温和的临床症状： 体重下降更少，体温更高（提示更强的免疫激活），MSS评分更高但血小板减少症改善，肝肾功能指标未见严重损伤。 * 更强的病毒清除能力： 血清病毒载量显著降低，肺、脾、肾等组织中病毒NP蛋白表达明显减少。 * 增强的先天免疫反应： 肺和脾脏组织中STAT1的磷酸化水平更高，ISGs（如MX1， ISG15）的表达显著上调。 * 不同的炎症病理特征： 肺部出现更显著的巨噬细胞（F4/80+）浸润和活化，但肾脏等靶器官的病理损伤较轻。这提示RIPK3缺失导致的强力ISG反应有效控制了病毒复制，虽然引发了更强的炎症细胞浸润，但这种炎症是可控且有助于病毒清除的。
研究的结论与价值 本研究得出结论：HTNV在感染后期通过上调宿主蛋白RIPK3的表达，利用其非经典功能——即通过蛋白激酶结构域直接结合并抑制转录因子STAT1的磷酸化，从而阻断干扰素下游的JAK-STAT信号通路和ISGs的表达。这一策略使得病毒能够逃逸宿主在感染晚期产生的高水平干扰素的抗病毒效应，为病毒自身的持续复制创造了有利条件。
科学价值： 1. 揭示了HTNV免疫逃逸的新机制： 阐明了HTNV如何“化解”晚期干扰素风暴的攻击，为解决“高干扰素水平与高病毒载量并存”这一临床悖论提供了分子解释。 2. 拓展了对RIPK3蛋白功能的认知： 发现了RIPK3在病毒感染中一种全新的、不依赖于激酶活性和坏死性凋亡的功能，即作为先天免疫信号（特别是JAK-STAT通路）的负调控因子。这丰富了我们对RIPK3这类多功能蛋白在宿主-病原体相互作用中复杂角色的理解。 3. 提供了潜在的抗病毒治疗新靶点： 研究表明，靶向RIPK3-STAT1相互作用界面，开发能够破坏该互作的小分子抑制剂或肽类化合物，有望恢复宿主在HTNV感染晚期的有效干扰素应答，从而控制病毒复制、减轻疾病严重程度。这为开发治疗HFRS的新型药物指明了方向。
研究的亮点 1. 研究视角新颖： 从“病毒如何逃逸晚期干扰素应答”这一独特且重要的临床问题切入，研究立意具有明确的生理和病理意义。 2. 机制解析深入且系统： 研究从表型观察（细胞死亡、病毒复制）到通路筛选（RNA-seq），再到关键分子鉴定（RIPK3），最后深入到精确的分子互作机制（结构域映射、激酶活性非依赖性），逻辑链条完整，证据层层递进。 3. 体内外模型结合验证充分： 综合利用了多种细胞系、原代BMDMs以及基因敲除小鼠模型，从细胞水平到整体动物水平全面验证了RIPK3的功能和作用机制，使结论非常坚实。 4. 发现了RIPK3的非经典功能模式： 明确区分了RIPK3的激酶活性与其蛋白支架功能，揭示了其通过蛋白-蛋白直接相互作用调控信号通路的新机制，这是本研究的核心创新点。
其他有价值的内容 研究还附带了一些有价值的发现和讨论：例如，研究观察到RIPK3缺失的BMDMs在感染晚期表现出向促炎（M1样）表型转化的趋势（IL-1β， IL-6上调，IL-10， Arg-1下调）。在动物模型中，RIPK3-/-小鼠肺部出现了显著的巨噬细胞浸润和活化。这些发现将RIPK3的功能与感染期间的炎症调节和免疫细胞功能联系了起来，为进一步研究RIPK3在免疫调控中的作用开辟了新的思路。此外，论文也对HTNV可能通过TLR3等途径激活RIPK3、以及MLKL可能参与的其他非死亡功能（如自噬）进行了探讨和展望，为后续研究提供了线索。