人类胰腺脂肪酶相关蛋白hPLRP1和hPLRP2的发现、表达与功能分化
研究团队与发表信息
本研究由瑞士巴塞尔F. Hoffmann-La Roche公司的Thomas Giller、Petra Buchwald、Denise Blum-Kaelin以及通讯作者Willi Hunziker共同完成，发表于*The Journal of Biological Chemistry*（1992年，第267卷第23期，页码16509–16516）。研究团队隶属制药研究部门的新技术研究部与代谢疾病临床前研究部。
学术背景与研究目的
胰腺脂肪酶（pancreatic lipase, PL）在膳食脂肪吸收中发挥关键作用，其将甘油三酯水解为甘油二酯、甘油一酯及游离脂肪酸。此前，已在人、猪、犬、大鼠和小鼠等物种中确定了PL的氨基酸序列，并明确了其与肝脂肪酶（hepatic lipase）和脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase）共同构成一个脂肪酶基因家族。人胰腺脂肪酶（hPL）的三维结构解析显示其具有N端大结构域（含催化三联体Ser-154、Asp-178和His-265）和C端结构域，活性中心被一个表面环（surface loop）覆盖，界面激活涉及该环的构象变化。此外，催化必需的氧阴离子洞（oxy-anion hole）由Phe-79和Leu-155残基构成。
传统上认为胰腺脂肪酶仅表达于外分泌胰腺，但1990年Grusby等报道了在白细胞介素-4（IL-4）刺激的小鼠细胞毒性T细胞中表达一种与PL高度同源的脂肪酶，其脂解活性部分依赖辅脂酶（colipase）。这一发现暗示胰腺脂肪酶族可能存在更多成员。因此，本研究旨在探索人类是否存在除传统hPL之外的胰腺脂肪酶相关蛋白，并对其生化特性、辅脂酶依赖性及进化关系进行系统分析。
研究流程与方法详述
1. cDNA克隆与序列分析
研究起始于对人胰腺cDNA文库（由瑞典哥德堡大学Gunnar Bjursell教授提供）的筛选。基于猪和犬PL保守区以及hPL胰蛋白酶肽段的氨基酸序列，设计了四组简并寡核苷酸探针（探针1和5、探针3和4），在低严谨度条件下进行杂交，分离获得三类相关克隆。第一类经重叠群拼接和PCR扩增得到全长hPL cDNA，其开放阅读框（open reading frame, ORF）为1395 bp，编码465个氨基酸，序列与hPL晶体结构解析序列（Winkler等, 1990）及Lowe等（1989）报道的序列完全一致，确认为真正的胰腺脂肪酶。第二类为部分克隆，再次筛选另一自建的胰腺cDNA文库后获得全长序列，命名为hPLRP1（human pancreatic lipase related protein 1），ORF编码468个氨基酸。第三类直接获得全长克隆，命名为hPLRP2，编码469个氨基酸。所有序列均提交至GenBank/EMBL数据库（登录号M93283–M93285）。序列分析采用GCG程序包进行比对与同源性计算。
2. 表达质粒构建与细胞转染
将三种cDNA分别克隆至真核表达载体pSG5的SV40启动子下游。hPL的完整编码区通过PCR从胰腺cDNA扩增，引物引入HindIII位点和优化的Kozak序列，克隆至pUC18的SmaI位点后再次亚克隆至pSG5的EcoRI-BamHI位点。hPLRP1的EcoRI-HindIII片段直接插入pSG5。hPLRP2因5´端存在克隆人工序列，通过PCR（20循环）修饰并替换原片段，测序确认后以EcoRI片段克隆入pSG5。
将表达质粒分别与β-半乳糖苷酶表达质粒pCH110共转染COS-1细胞。转染采用改良的Transfectam法，细胞培养于含8%胎牛血清的DMEM培养基中，转染后1小时换为正常生长培养基。24小时后更换为无血清OptiMEM并加入[³⁵S]甲硫氨酸进行代谢标记，48小时后收集上清液，过滤除菌后保存。转染效率通过LacZ染色确认高达80%。
3. 蛋白检测与免疫印迹
标记上清液经三氯乙酸沉淀后进行SDS-PAGE和放射自显影分析。同时，使用纯化hPL免疫家兔制备的多克隆抗血清（1:3000稀释），对电转印至硝酸纤维素膜上的蛋白进行Western blot检测。
4. 脂肪酶活性测定
采用pH-stat法（Metrohm滴定仪，100 μL注射器改装）测定上清液的脂解活性。底物乳剂由三油酸甘油酯（42 mg/mL）、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、胆固醇、磷脂酰胆碱及无脂肪酸牛血清白蛋白等组成，pH 8.0。测定时加入过量粗制牛辅脂酶或省略辅脂酶以评估辅脂酶依赖性。以纯化天然hPL为标准绘制活性当量曲线。抑制实验使用脂肪酶抑制剂orlistat（RO 18-0647），测定半数抑制浓度IC₅₀。
5. RNA分析
从健康器官捐献者的胰腺组织中提取总RNA（缺血时间<30秒），取3 μg上样于琼脂糖凝胶电泳，转印至Zeta-Probe GT膜上。分别使用hPL、hPLRP1和hPLRP2的随机引物标记探针，在50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖杂交液中42℃杂交，随后用2×SSC、0.1% SDS于65℃洗涤，放射自显影。以小鼠β-肌动蛋白探针重新杂交作为内参。
主要结果
序列特征与同源性分析
推导的氨基酸序列对比显示，hPLRP1和hPLRP2与hPL的氨基酸序列同一性分别为68%和65%。三者均具有疏水信号肽，信号肽酶切割位点（G/KEV）保守，预测成熟蛋白长度分别为449、450和452个氨基酸。hPL的14个半胱氨酸中，除第6位半胱氨酸在hPLRP1中被丝氨酸替代外，其余均保守；此外hPLRP2在第387位多出一个半胱氨酸。三者均含催化三联体和氧阴离子洞残基。
序列比对与系统进化树（Pileup程序构建）揭示脂肪酶基因家族分为脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶和胰腺脂肪酶三大支。胰腺脂肪酶支进一步分为三个亚支：真正的PL（人、猪、大鼠）、PLRP1（犬“PL”、另一种大鼠“PL”被重新归类为PLRP1的正交基因）和PLRP2（人hPLRP2与小鼠T细胞脂肪酶）。hPLRP1与犬PL（Kerfelec等, 1986）及第二种大鼠PL（Wicker-Planquart & Puigserver, 1992）的序列同一性最高，达85–91%；hPLRP2则与小鼠T细胞脂肪酶（Grusby等, 1990）最近缘。这提示在哺乳动物分化（约9千万年前）之前，通过两次基因重复事件先形成了PLRP2与PL/PLRP1祖先，随后再次重复产生PL和PLRP1。
表达与生化特性
SDS-PAGE显示，转染细胞上清液中三种蛋白的分子量均在45–60 kDa范围内，但糖基化模式不同：无N-糖基化位点的hPLRP1呈现锐利条带（47 kDa）；含一个位点的hPL表现为弥散条带（约47 kDa）；含两个位点的hPLRP2条带更弥散且分子量稍大（约50 kDa）。Western blot证实抗hPL抗体与hPLRP1和hPLRP2仅有微弱交叉反应。
活性测定结果（表II）显示，COS细胞表达的hPL与纯化天然hPL一致，其脂解活性绝对依赖辅脂酶：缺失辅脂酶时活性和不可测得，加入辅脂酶后hPL样品活性为19.50 U/mL（活性当量8.13 μg/mL），天然酶为31.20 U/mL（13.0 μg/mL）。hPLRP2无论是否添加辅脂酶均具有明显活性，缺失辅脂酶时为7.74 U/mL，添加辅脂酶后略微增至9.94 U/mL，表明其活性仅弱依赖辅脂酶。hPLRP1在标准PL测定条件下无论有无辅脂酶均未检测到任何脂解活性，即使样品用量增加10倍亦如此，暗示其可能需不同的底物或辅因子。Orlistat对三种具有活性的样品均表现抑制作用，IC₅₀在0.065–0.21 μg/mL之间，且不受辅脂酶存在与否的显著影响。
组织表达分析
Northern印迹显示胰腺总RNA中均能检出约1.8 kb的主要转录本。hPLRP2还出现约2.3 kb（强度相似）和3.9 kb（较弱）的额外条带；较长时间曝光后hPLRP1亦可见更大转录本。通过达到相似信号强度所需曝光时间估算，hPL mRNA丰度最高，hPLRP1约为其1/4，hPLRP2仅为其1/24。尝试在IL-4刺激的人CD8⁺ T细胞克隆或多克隆刺激的外周血淋巴细胞中检测hPLRP2转录本，未获得阳性结果。
结论与科学价值
本研究首次鉴定并克隆了两种新型人类胰腺脂肪酶相关蛋白hPLRP1和hPLRP2，证明了胰腺脂肪酶家族不仅包含传统PL，还存在两个旁系同源成员。序列保守性和进化树分析表明该三成员亚家族在哺乳动物中普遍存在，过去一些被报道为“胰腺脂肪酶”的序列实为PLRP1或PLRP2的正交基因。hPLRP1虽高度保守且在胰腺中表达，但在标准PL测定条件下无活性，排除了其仅是失活假基因的可能，强烈提示其具有独特的生理功能，可能作用于不同脂类底物或需特殊辅因子。hPLRP2具有显著的辅脂酶独立性脂解活性，与小鼠T细胞脂肪酶特性一致，确认了二者为正交基因，但其在人类T细胞中的表达受限表明该蛋白功能可能超越细胞毒性T细胞范畴。
该研究不仅拓展了对脂肪酶基因家族构成与演化的认识，也为深入探索脂质消化与代谢的新机制提供了分子工具。尤其hPLRP2因辅脂酶依赖性弱，可作为对比模型用于解析辅脂酶激活hPL的结构基础。未来需进一步明确两种新蛋白的组织分布、底物特异性及生理功能。
研究亮点
1. 发现两类新蛋白：在已知的唯一胰腺脂肪酶之外，鉴定出hPLRP1和hPLRP2，并证实其并非同工酶，而是由不同基因编码的独立成员。
2. 进化框架的重塑：通过系统发生分析，将胰腺脂肪酶支细分为三个亚支，纠正了既往物种间序列分类的错误，并推测基因重复发生于哺乳动物辐射之前。
3. 功能分化的直接证据：COS细胞表达系统证实hPLRP2活性仅微弱依赖辅脂酶，hPLRP1则在本实验条件下无活性，从功能层面凸显了亚家族成员的分化。
4. 保守性与功能约束：尽管hPLRP1无检测活性，其序列在物种间的高度保守性表明其承受着强烈的功能约束，极可能参与尚未发现的生理过程。
5. 与免疫系统的潜在联系：hPLRP2与小鼠IL-4诱导的T细胞脂肪酶的高度同源，为免疫-代谢交叉研究提供了线索。