本文属于类型a，即单项原始研究的学术报告。

该研究由Sarah Martinez、David N. Bernard、Marie-Christine Groleau、Mylène C. Trottier以及Eric Déziel等人完成，主要作者来自加拿大魁北克拉瓦尔市的Institut national de la recherche scientifique（INRS）下属Centre Armand-Frappier Santé Biotechnologie。该论文发表于*Bioresource Technology*期刊第425卷，文章编号为132255，于2025年2月26日在线发表。

学术背景

微生物表面活性剂（biosurfactant）如鼠李糖脂（rhamnolipids）被认为是合成表面活性剂的有前景替代品，因其具有可生物降解、低毒性和可利用可再生资源生产等优点。然而，目前利用微生物生产鼠李糖脂的工艺效率普遍较低，产量限制了其商业化应用。传统上提高次级代谢产物产量的方法包括培养条件优化、高产菌株筛选以及随机诱变等，但这些方法往往劳动密集且改进幅度有限。适应性实验室进化（adaptive laboratory evolution, ALE）是一种通过施加实验选择压力、使自然选择作用于特定表型并伴随基因组改变的定向进化策略，但在非必需功能（如次级代谢产物生产）方面，由于需要提高突变体的适应性，找到合适的选择条件具有挑战性。泰国伯克霍尔德菌（*Burkholderia thailandensis*）是一种非致病性细菌，能够产生鼠李糖脂，且具有作为工业鼠李糖脂生产菌株的潜力。该菌可以表现出一种称为集群运动（swarming motility）的社会性表面运动行为，这种运动需要功能性鞭毛和表面润湿剂（如鼠李糖脂）的产生。实验室条件下，集群运动通常在含0.5%琼脂的培养基平板上观察到。提高琼脂浓度会增加表面硬度，从而对集群运动产生负面影响。基于此，作者提出假设：通过逐步提高琼脂浓度，对细菌施加选择压力，迫使细胞产生更多鼠李糖脂以降低表面张力，从而实现有效的集群扩散，进而筛选出鼠李糖脂高产突变体。

详细研究流程

本研究主要包括定向进化实验、高产克隆筛选、全基因组测序与突变分析、qsmR基因功能验证、转录调控机制解析等步骤。

首先，作者以B. thailandensis E264野生型菌株为出发菌株，进行了定向进化实验。实验采用含有0.5%葡萄糖的营养肉汤（nutrient broth, NB）培养基，分别添加0.5%、1.5%和2.5%三种浓度的琼脂制备平板。初始培养物通过将E264菌株在NB加4%甘油培养基中过夜培养获得。每个平板中心接种5微升OD600为3.0的细菌培养液，在30°C培养16小时。之后，用棉签完整刮取平板上生长的菌落，重悬于磷酸盐缓冲液（PBS），调整OD600至3.0，再接种新的集群运动平板。此过程每16小时重复一次，连续进行10天（即10次传代）。同时，在无琼脂的液体培养基中进行平行传代作为对照。每个实验条件设置三个独立的谱系重复，整个实验独立重复三次。

接下来，对经过10轮选择的进化群体进行鼠李糖脂产量定量分析。将进化群体和野生型E264在NB加4%甘油液体培养基中培养5天，采用液相色谱-串联质谱（LC/MS）测定上清液中的鼠李糖脂浓度。结果显示，液体传代对照群体的鼠李糖脂产量与野生型相似，而在琼脂平板上传代的群体产量显著提高；琼脂浓度越高，产量增加越多，但在1.5%琼脂时达到平台期。

为了获取单克隆高产菌株，作者将1.5%琼脂板上进化后的群体稀释涂布获得单菌落，每个谱系随机挑选10个克隆（共30个），分别测定其鼠李糖脂产量。结果显示，13个克隆的产量至少是野生型的3倍，其中谱系3的C5克隆产量为野生型的7倍。

随后，对每个谱系中产量最高的两个克隆（共6个）进行全基因组测序，并与E264参考基因组比较，鉴定单核苷酸多态性（SNP）、插入和缺失。测序结果显示，6个克隆中有3个在*bth_i2865*位点携带突变。谱系2的C1和C7克隆携带相同的SNP（c.230 T>C），导致第77位亮氨酸被脯氨酸取代（L77P）；谱系3的C7克隆则携带多个突变（SNP和缺失），导致从第168位氨基酸开始发生移码。*bth_i2865*编码一个IclR型转录调节因子，与*Burkholderia glumae*中的QsmR调节因子同源。此外，测序还发现其他克隆在*bth_ii0885*（TetR家族转录调节因子）、*bth_i2820*（预测的双加氧酶）和*bth_ii0864*（VI型分泌系统ATP酶ClpV-5）位点存在突变，但这些基因此前均未知与鼠李糖脂生产相关。由于*qsmR*突变在多个独立谱系中反复出现，作者判断这是强烈选择压力下获得的适应性性状。

为了验证QsmR对鼠李糖脂生产的调控作用，作者从转座子突变体库中获取了*qsmR-1*突变体（bt09539），并检测其集群运动能力和鼠李糖脂产量。结果显示，*qsmR-1*突变体表现出超集群（hyperswarmer）表型，且鼠李糖脂产量显著高于野生型。将表达*qsmR*基因的质粒pSM1导入*qsmR-1*突变体后，鼠李糖脂产量恢复至野生型水平，证实了表型变化确实由*qsmR*失活引起。同时，作者监测了*qsmR-1*突变体和野生型在培养过程中的pH变化，发现两者pH曲线相似，排除了鼠李糖脂过表达由pH变化间接导致的可能性。

为了揭示QsmR调控鼠李糖脂生产的机制，作者利用携带*lacZ*转录融合报告基因的质粒pAH5（对应*rhlA1*启动子）和pAH8（对应*rhlA2*启动子），分别转化野生型和*qsmR-1*突变体，进行β-半乳糖苷酶活性测定。培养条件为NB加4%甘油，每8小时取样一次，持续72小时。结果显示，*qsmR-1*突变体中两个*rhl*操纵子的转录水平均高于野生型，其中对*rhlA2*操纵子的影响更为显著。这表明进化克隆中的*qsmR*突变解除了QsmR对鼠李糖脂生物合成操纵子转录的抑制作用，从而导致了鼠李糖脂的过量生产。

此外，作者还探讨了*qsmR*是否通过调控下游基因影响鼠李糖脂生产。生物信息学分析表明，*qsmR*（*bth_i2865*）可能与*bth_i2866*、*bth_i2867*和*bth_i2868*形成操纵子，后三者预测编码RND转运蛋白家族的同源物（分别与MdtA、MdtB和MdtC同源）。RT-qPCR结果显示，在*qsmR-1*突变体中*bth_i2866*表达上调5倍，说明QsmR确实抑制该操纵子的转录。但对*bth_i2866*、*bth_i2867*和*bth_i2868*转座子突变体的鼠李糖脂产量进行检测后，发现与野生型无显著差异，因此排除了该推测外排系统对鼠李糖脂生产的影响。

主要结果

本研究成功建立了一种基于集群运动的定向进化策略，用于筛选鼠李糖脂高产突变体。经过10轮在增加琼脂浓度的平板上进行的选择，进化群体的鼠李糖脂产量显著提高，且与琼脂浓度呈正相关，直到1.5%琼脂时达到平台期。从进化群体中分离的30个克隆中有13个产量至少为野生型的3倍，最高可达7倍。

全基因组测序显示，6个测序克隆中有3个在*qsmR*基因中发生了功能丧失突变，表明*qsmR*是鼠李糖脂生产的抑制因子。功能验证实验证实，*qsmR*失活导致超集群表型和鼠李糖脂过量生产，而基因互补可恢复野生型表型。转录分析进一步表明，QsmR通过抑制两个*rhl*生物合成操纵子的转录来调控鼠李糖脂生产，其中对*rhlA2*操纵子的影响更强。此外，通过蛋白序列比对和Alphafold结构预测，作者发现谱系2的L77P突变位于螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix）DNA结合结构域的α螺旋中，脯氨酸的引入破坏了氢键，可能降低调节因子与靶DNA的亲和力；而谱系3的移码突变则破坏了效应物结合结构域，可能影响蛋白质与配体的结合，导致调节因子功能丧失。

结论与意义

本研究首次报道了一种利用适应性实验室进化策略来提高微生物表面活性代谢物产量的方法。通过将集群运动所需的表面润湿性与琼脂浓度所施加的表面张力选择压力相结合，作者成功筛选出了鼠李糖脂产量比野生型高7倍的突变体，并揭示了QsmR作为鼠李糖脂生物合成的转录抑制因子的新功能。该方法不依赖于生存作为选择因素，而是针对非必需的次级代谢产物进行定向进化，因此具有广泛的适用性和应用潜力，可用于其他产生物表面活性剂的微生物的菌种改良。此外，该研究还扩展了对*B. thailandensis*中鼠李糖脂生物合成调控网络的认识，为未来通过代谢工程手段进一步提高鼠李糖脂产量奠定了基础。

研究亮点

本研究的亮点包括：1）首次将集群运动与琼脂浓度选择压力相结合，成功建立了针对非必需次级代谢产物的适应性实验室进化方法；2）通过平行进化中独立出现的*qsmR*突变，揭示了QsmR作为鼠李糖脂生产抑制因子的新功能；3）结合全基因组测序、遗传互补、转录报告基因分析和蛋白结构预测等多种手段，系统地解析了突变对蛋白功能和基因调控的影响；4）该策略具有普适性，可推广至其他产生物表面活性剂的微生物。