类型a: 单项原创研究报告
本文是关于一种创新活细胞多重荧光成像方法的新研究，发表在《Nucleic Acids Research》期刊上，文章标题为“Multiplexed Sequential Imaging in Living Cells with Orthogonal Fluorogenic RNA Aptamer/Dye Pairs”。以下是对该研究的综合介绍和详细解读。
研究背景
- 作者及机构：该研究由来自美国马萨诸塞大学阿默斯特分校化学系、化学工程系，以及中国南京理工大学化学与化工学院等单位的团队完成，通讯作者包括Mingxu You、Rigumula Wu和Kewei Ren。
- 发表时间与期刊：研究发表于《Nucleic Acids Research》2024年第52卷，文章编号e67。
- 研究领域与背景：
- 细胞生物学中，监测细胞内多种分子目标的分布和动态变化对理解分子机制至关重要。
- 当前的荧光显微技术受限于荧光光谱的重叠性，使得同时检测多于三种目标成为技术瓶颈。
- 尽管现有的多重成像方法（如MERFISH和SeqFISH）解决了固定细胞样本中的多重检测问题，但活细胞成像尚缺乏有效的多重检测工具。
- 为解决这一问题，作者提出了基于RNA荧光适配体和荧光染料配对的“Sequential Fluorogenic RNA Imaging-Enabled Sensor（SeqFRIES）”技术。
研究目的
- 核心目标：开发一种可用于活细胞环境的高效多重成像方法，通过多轮“成像-去除”循环实现多重目标检测。
- 关键创新：
- 引入正交的荧光RNA适配体和染料配对体系。
- 利用非共价、可逆的RNA/染料结合机制，实现荧光的可控激活和去除。
- 提供快速（约20分钟）的多色成像流程，并扩展其在细胞信号分子和mRNA靶标检测中的应用。
研究方法
正交RNA/染料配对的筛选与优化：
- 筛选出四对正交的荧光RNA适配体/染料配对：Broccoli/DFHBI-1T、Corn/DFHO、DNB/TMR-DN、Pepper/HBC620。
- 测试这些配对在细菌和哺乳动物细胞中的荧光激活/去除动力学，优化了荧光的“开启-关闭”速率。
- 例如，Broccoli/DFHBI-1T和Corn/DFHO在细胞内可在7-8分钟内达到最大激发强度。
多重成像实验设计：
- 在大肠杆菌和HEK293T细胞中分别转染多个RNA适配体基因，并使用SeqFRIES流程实现多轮成像。
- 采用两个染料的快速双通道成像方法，将整个多色检测时间缩短至20分钟。
- 实验验证了在每轮成像后，荧光信号可通过简单的洗脱步骤被去除，为下一轮检测提供了无背景的条件。
数据分析与验证：
- 使用ImageJ软件对成像数据进行定量分析，测试荧光信号的相关性。
- 通过内参比值校正，分析了不同实验条件下的分子浓度变化。
研究结果
四对正交RNA/染料配对的特性验证：
- 实验表明，这四对配对具有高度的正交性和优异的荧光强度，可在相同细胞环境下独立工作。
- 通过快速成像-去除循环，能够在单个细胞中实现四种目标的多重成像。
细菌和哺乳动物细胞中的多重成像：
- 在大肠杆菌和HEK293T细胞中，成功实现了对多个RNA适配体的快速顺序检测。
- 对哺乳动物细胞中信号分子（如c-di-GMP和ppGpp）和内源性mRNA靶标（如HER2、STAT3和TK1）的检测表明，SeqFRIES具有较高的灵敏度和特异性。
高稳定性与低毒性：
- 通过环状RNA的设计，延长了荧光信号的稳定性，同时在多轮成像过程中未观察到显著的细胞毒性。
研究结论与意义
结论：
- SeqFRIES是一种突破性的多重成像方法，通过正交荧光适配体/染料配对解决了传统荧光光谱重叠的问题。
- 该技术不需要固定细胞或复杂的设备，可以在常规荧光显微镜下实现高效的多重检测。
科学价值：
- 为活细胞环境中的多分子动态检测提供了新的工具，可广泛应用于细胞信号网络分析、单细胞分子分析和疾病研究。
- 提供了一种模块化的、多用途的RNA传感器开发平台，为未来检测更多分子目标奠定了基础。
应用价值：
- SeqFRIES的灵活性和高通量性适合于生命科学实验室中常规使用，有望在药物筛选、肿瘤生物标志物检测等领域产生广泛的应用。
研究亮点
- 技术创新：首次在活细胞中实现基于RNA适配体的多轮“成像-去除”循环。
- 多样性：SeqFRIES适用于细菌和哺乳动物细胞，且支持多种靶标分子（包括信号分子和mRNA）的检测。
- 可编程性：RNA适配体的模块化设计使得该方法具有高度的通用性，可扩展至更多的分析对象。
展望
研究团队指出，未来可以通过： 1. 进一步开发更多正交的RNA/染料配对，提高多重检测能力； 2. 优化实验流程，减少操作步骤，实现自动化； 3. 在定量分析中加入更精确的内参校正，提升检测灵敏度和动态范围。
SeqFRIES平台将为生命科学领域的多重检测研究开启新的可能性，推动单细胞分子生物学的进步。