本文属于类型a，即单篇原创研究报告。以下为根据该文档内容撰写的学术报告。

研究作者与发表信息

本研究由Tiziana Altosole、Gianluca Rotta、Chiara R.M. Uras、Scott J. Bornheimer和Daniela Fenoglio等人完成。第一作者Tiziana Altosole来自意大利热那亚IRCCS Ospedale Policlinico San Martino，通讯作者Daniela Fenoglio来自意大利热那亚大学内科学系及IRCCS Ospedale Policlinico San Martino生物治疗单元。其他作者分别来自BD Biosciences Europe、热那亚大学实验医学系以及BD Biosciences USA。该研究发表于*Journal of Immunological Methods*，文章于2023年2月24日在线发表，卷号为515，文章编号113443。

研究背景与目的

抗原特异性T细胞（antigen-specific T cell）的分析在感染性疾病、肿瘤及疫苗免疫应答研究中具有重要意义。传统的肽/HLA多聚体（peptide/HLA multimer）技术能够较准确地检测抗原特异性T细胞，但该方法受限于已知免疫原性肽、HLA等位基因限制以及试剂可及性，尤其是对于CD4+ T细胞而言。基于活化诱导标志物（activation-induced markers，AIM）的流式细胞术方案近年来成为一种重要的替代方法，其原理是通过T细胞受体（TCR）刺激依赖的标志物上调来识别抗原应答性T细胞，无需预先知晓表位信息。然而，单独使用AIM检测虽然能够评估抗原特异性T细胞的频率，但无法提供关于细胞功能状态的信息，如细胞因子分泌表型。因此，本研究旨在优化一种能够同时检测AIM和细胞内细胞因子的流式细胞术方案，从而在保持AIM阳性信号的同时评价抗原特异性T细胞的功能特征。

研究团队选择了SARS-CoV-2刺突蛋白（spike protein）和巨细胞病毒（CMV）抗原来验证该方案。他们的目标是建立一种不依赖HLA多聚体、可在体外短时间刺激后同时描述CD4+和CD8+ T细胞活化及细胞因子产生的方法，并进一步结合T细胞成熟标志物和滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells，Tfh）的检测，以更全面地刻画抗原特异性T细胞应答。

研究设计与实验流程

本研究的方法优化主要围绕三个关键问题展开：细胞因子分泌抑制剂对AIM表达的影响、AIM标志物的组合选择、以及流式染色方案与数据分析策略。外周血单个核细胞（PBMCs）来自接种BNT162b2疫苗并经历SARS-CoV-2感染的健康志愿者。每份样本使用10^6个PBMCs，在96孔圆底板中培养，分别用SARS-CoV-2刺突蛋白肽池或CMV pp65和IE-1肽池刺激，同时加入抗CD28单克隆抗体作为共刺激分子。培养4小时后加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A，BFA）以阻断蛋白转运，继续培养16、20或24小时。

在AIM标志物的选择上，研究比较了细胞内（intracellular，ic）和表面（surface，s）染色条件下CD134（OX40）和CD69与ic-CD137（4-1BB）的共表达情况。结果显示，ic-CD69与ic-CD137在CD4+和CD8+ T细胞中均有极强的相关性，线性回归斜率均为1.00，R²均为0.999。相反，ic-CD134在ic-CD137bright CD4+ T细胞上的共表达较差，斜率仅为0.21；s-CD69的共表达也明显弱于ic-CD69。此外，s-CD134在ic-CD137bright事件上几乎完全不表达。在细胞因子产生细胞中，ic-CD69同样表现出与ic-CD137bright细胞因子阳性事件的完全一致，而ic-CD134和s-CD69均未能有效标记这些细胞。克隆比较显示，即使使用文献中推荐的CD134克隆ACT35，其与ic-CD137的共表达仍远低于ic-CD69。基于这些结果，ic-CD69被确定为本方案中与ic-CD137联合使用的最佳AIM标志物。抗CD49d共刺激分子未显著提高抗原应答T细胞的检出率，因此未被纳入最终方案。

在方案设计中，CD134被替换为CXCR5，以用于检测滤泡辅助性T细胞（Tfh）。同时，通过将CD45RA抗体移至更亮的荧光通道BV786，提高了T细胞成熟曲线分析的灵敏度。数据采集使用BD FACSCelesta或BD FACSymphony A3流式细胞仪。分析策略包括排除双联体细胞、圈定活淋巴细胞，并通过CD3、CD4、CD8、CD45RA、CCR7、CXCR5、ic-CD137、ic-CD69以及细胞内IFNγ、TNFα和IL-2进行表型分析。抗原应答（antigen responding，AR）T细胞定义为刺激样本中AIM+细胞百分比减去未刺激样本中的AIM+细胞百分比。响应者标准定义为AR CD4+或CD8+细胞百分比≥0.08%，该阈值可确保每个刺激样本中至少收集50个AIM+事件，且刺激与未刺激之间的差异事件数大于20个。

主要研究结果

在确定ic-CD69为最佳伴随标志物后，研究团队用优化后的方案评估了10名捐献者的PBMCs，其中4名进行了三次重复实验。结果显示，在刺突蛋白刺激下，10名捐献者中有9名为CD4+应答者，4名为CD8+应答者；在CMV刺激下，分别有5名CD4+应答者和4名CD8+应答者。应答者样本中，刺激样本的AIM+事件数显著高于未刺激样本。

在细胞因子产生方面，刺突蛋白刺激的CD4+ AIM+细胞中约81%产生至少一种细胞因子，CD8+ AIM+细胞中该比例为30%；经背景校正后，该比例分别升至87%和52%。CMV刺激的相应比例分别为83%和81%，背景校正后为92%和90%。CD4+ AIM+细胞中，刺突蛋白刺激下IFNγ+、TNFα+和IL-2+细胞的比例分别为69.5%、62.9%和78.5%；CD8+ AIM+细胞中分别为89.1%、59.9%和20.9%。CMV刺激下也表现出类似的CD8+偏向IFNγ产生、CD4+偏向IL-2产生的模式。

T细胞成熟分析显示，AIM+ CD4+ T细胞以效应记忆（effector memory，EM）表型为主，AIM+ CD8+ T细胞以终末分化效应记忆（terminally differentiated effector memory，TEMRA）表型为主，且与总CD4+或CD8+群体相比呈现明显的成熟偏移。此外，在AIM+群体中检测到少量CD4+幼稚样细胞，其CCR7表达水平低于总幼稚群体，提示可能存在旁观者激活（bystander activation）。

在Tfh细胞分析中，9名刺突蛋白CD4+应答者中有8名在刺激后表现出AIM+ Tfh细胞比例增加；CMV应答者中仅2/5显示出类似增加。尽管单个捐献者水平上事件数有限，但组间比较显示，刺突蛋白刺激样本与未刺激样本之间AIM+ Tfh细胞的差异具有统计学显著性，p值为8×10⁻⁵。

研究结论与意义

本研究成功建立了一种优化的流式细胞术方案，能够在一次实验中同时检测CD4+和CD8+ T细胞的AIM和细胞内细胞因子表达。该方案的核心创新在于：使用细胞内CD137与细胞内CD69联合作为AIM标志物，避免了因BFA阻断表面蛋白转运而造成的AIM表达低估；同时，将T细胞成熟标志物CD45RA、CCR7和Tfh标志物CXCR5纳入同一面板，实现了对抗原特异性T细胞功能状态和分化阶段的更全面描述。该方法可应用于SARS-CoV-2和CMV等多种抗原的特异性T细胞分析，并具有推广至其他感染性疾病、肿瘤免疫和疫苗评价的潜力。

研究亮点

本研究的亮点包括：首次系统比较了ic-CD134、s-CD134、s-CD69与ic-CD69在同时检测AIM和细胞内细胞因子条件下的表现，明确了ic-CD69与ic-CD137在CD4+和CD8+ T细胞中的完全一致性；通过去除信息量较低的CD134并引入CXCR5，在不增加荧光通道负担的情况下实现了Tfh细胞的检测；建立了一套适用于12色流式面板的完整染色和分析流程。尽管研究样本量较小且部分捐献者存在混合免疫背景，该方法仍展现出在单次实验中对T细胞活化、细胞因子产生和分化状态的整合分析能力，为后续更大规模的免疫监测研究提供了可行工具。