学术报告：基于CSAT2.0的一步无柱高效蛋白纯化方法

作者和研究机构

本文为单篇原创科研研究报告，作者为Yuan Huang、Yuanyuan Zhang、Xiaofeng Yang（lead contact, South China University of Technology）、Zhanglin Lin（lead contact, Guangdong University of Technology）。论文发表在 Trends in Biotechnology（2024年，Online First）。通讯作者邮箱分别为 biyangxf@scut.edu.cn 和 zhanglinlin@gdut.edu.cn。

学术背景

蛋白质纯化（Protein purification）是生命科学和生物技术领域的基础技术之一，高纯度蛋白的供应对于蛋白研究及其在生化结构研究、治疗开发等应用中至关重要。然而，通过重组宿主表达蛋白质后，从宿主细胞蛋白背景（Host Cell Proteins, HCPs）中分离目标蛋白仍然是一个重大挑战。传统基于柱层析的纯化方法虽然成熟，但纯化步骤繁多、成本高昂且收率较低。

作者所在团队在早期提出了无柱的CSAT蛋白纯化方法，即通过一个自组装肽（Self-assembling peptide, SAP）和自切割内含子（Intein）的组合，诱导目标蛋白形成功能性聚集体，并通过内含子自动切割释放目标蛋白。然而传统CSAT方法仍有主要杂质问题，即切割后的标签片段可能重新溶解，导致蛋白纯化纯度不足。本研究通过引入一个新型肽段（Propeptide, PEP），改进为CSAT2.0体系，实现了 >98% 的蛋白纯度，显著提高了纯化效率并降低成本。

研究目标： 1. 提出并验证CSAT2.0方法的一步无柱蛋白纯化流程。 2. 测评其在实验室和中试规模下的鲁棒性、可扩展性，以及对不同类型蛋白的适用性。 3. 探讨其工业化应用潜力。

研究流程

1. 技术框架与方法改进 引入来源于Deinococcus gobiensis的前肽PEP，将其插入SAP与内含子之间以解决传统CSAT方法中洗脱标签片段重新溶解的问题。新体系命名为Cleavable Self-aggregating Tag 2.0（CSAT2.0），并通过流程图（Figure 1）阐明了其原理。

融合蛋白包含以下五部分： - SAP（如L6KD）：驱动目标蛋白形成活性聚集体。 - PT Linker：连接模块。 - PEP（76氨基酸）：通过紧固作用使标签的切割产物保持不溶状态。 - 内含子（Intein Mtu δI-CM）：介导自切割反应释放目标蛋白。 - 目标蛋白。

目标蛋白通过内含子自切割从聚集体释放，从而脱离大部分宿主细胞杂质。

2. 实验设计与验证 实验室规模测试主要在小型Shake Flask中进行，同时通过微量化实验（96孔板格式）与中试规模（5 L发酵罐）验证方法的鲁棒性和可扩展性。

（1）实验对象与样品 测试了1种肽和5种蛋白（其中3种含有二硫键）： - 肽：LCB3（无二硫键, 7.7 kDa），SARS-COV-2抗病毒肽。 - 治疗性蛋白：HGH（人类生长激素，含2个二硫键, 22.1 kDa）。 - 纳米抗体（Nanobody）：NB21（含1个二硫键, 12.6 kDa）和Caplacizumab（首个FDA批准纳米抗体药物，含2个二硫键, 27.9 kDa）。 - 酶类：GST（谷胱甘肽转移酶，无二硫键, 25.5 kDa）和木聚糖酶（无二硫键, 45.3 kDa）。

实验样品范围涵盖不同分子量（7.7~45.3 kDa）、二硫键数量（0到2对）、序列和结构特性。

（2）实验步骤与流程 - 蛋白表达：将目标基因插入到E. coli菌株，通过IPTG诱导表达。进行摇瓶培养或发酵罐发酵（5 L规模）。 - 蛋白纯化：目标蛋白形成不溶性聚集体，通过两次洗涤去除杂质后，以中性缓冲液调整pH以触发内含子自切割反应。 - 动态评估和活动验证：利用SDS-PAGE验证纯度，同时使用反相高效液相（RP-HPLC）验证纯度数据。采用多层干涉技术（Biolayer Interferometry, BLI）和标准酶活性测定验证蛋白活性。

主要实验结果

1. CSAT2.0在实验室规模的表现 经过CSAT2.0系统处理后，目标蛋白和肽的产量范围为24-89 mg/L，纯度均超过98%。以SDS-PAGE和RP-HPLC分析验证后，数据一致。

此外，通过生物学活性分析表明，所有纯化的蛋白均保持功能性： - LCB3和HGH的结合常数（KD）分别为0.59 nM和0.67 nM，与文献数据一致。 - NB21和Caplacizumab显示出极高的结合亲和力（KD <0.1 nM）。 - GST和木聚糖酶的酶活性分别为4.61 U/mg和325 U/mg，与市售对照一致。

2. 微量高通量平台验证 在96孔板小规模高通量测试中，目标蛋白产量为9-32 mg/L，纯度范围91%-98%。此方法成本低廉（US$50每过滤板）且灵活性高，与传统IMAC树脂板相比表现更优。

3. 工业化中试规模生产 在5 L发酵罐中生产Caplacizumab，产量高达1.4 g/L，纯度达99%。此结果达到了与实验室规模一致的纯化标准，表现出较高的工业应用潜力。

此外，初步研究显示，通过CSAT2.0生产HGH，5 L发酵罐中可达到2.5 g/L的表达量，纯度超过98%。

结论与意义

本研究首次提出了基于前肽（Propeptide）的CSAT2.0体系，无需传统柱层析即可实现成本低廉的一步蛋白纯化。该体系适用于多种含二硫键的功能蛋白，且极大地降低了常规纯化中的标签杂质问题，其创新价值包括：

1. 科学价值：阐明了前肽在保持切割标签不溶性中的关键作用，为新型蛋白纯化方法设计提供理论基础。
2. 应用价值：展示了从实验室小规模到工业中试规模的可扩展性，表明此方法在生物制药领域高效生产蛋白和酶的潜力。
3. 高通量平台潜力：实验表明CSAT2.0方法适用于药物筛选、抗体开发等高通量场景，有助于加速药物研发进程。

研究亮点

1. 技术创新：引入PEP成功解决红issolving杂质问题，使纯度提升到>98%。
2. 高效性：无需繁琐的层析步骤，成本显著低于传统方法。
3. 广泛适用性：成功表明对多种类型蛋白的纯化能力。
4. 可工业化扩展：高纯度、高产量展示了CSAT2.0的商业潜力。

未解问题与展望

论文提出PEP的分子机制尚未揭示，尤其是其如何增强切割片段不溶状态。同时，关于其能否应用于大规模生物反应器（>500 L）中，以及在其他宿主细胞（如酵母、昆虫细胞）中的适用性，仍需进一步研究。

这一创新方法或为生物制药、蛋白工程及相关领域提供重要工具，不断推动蛋白质研发与生产技术的进步。