本研究的主要作者为来自仲恺农业工程学院化学化工学院、农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室、广东省农业绿色精细化学品重点实验室的Zhong Ximing, Lan Ruopeng, Su Guofeng, Hao Li, Xu Hua, Zhou Hongjun* 和 Zhou Xinhua*。该研究论文发表于期刊《Chemical and Biological Technologies in Agriculture》2023年第10卷第140期。

一、 学术背景

本研究属于纳米技术与现代农业交叉领域，具体聚焦于利用纳米材料递送系统提升作物抗逆性的应用基础研究。其产生的背景源于全球性的土壤盐渍化危机。据文献所述，全球约有8亿公顷耕地受盐渍化影响，总面积甚至达到11.25亿公顷。盐胁迫会严重干扰植物正常生理活动，如降低水分和养分吸收，引发渗透胁迫和离子胁迫，进而导致活性氧（ROS）积累，造成氧化损伤。此外，盐胁迫还会抑制光合作用、细胞分裂，最终阻碍植物生长和发育。黄瓜作为一种全球重要的经济蔬菜，其生长对盐分敏感，盐胁迫会导致严重减产，加剧全球粮食供应的不稳定。因此，寻求有效增强作物耐盐性的方法刻不容缓。

油菜素内酯（Brassinolide, BR）作为一种高效、广谱、无毒的植物生长调节剂，被认为是第六类植物激素，在调节种子萌发、开花等生长阶段以及增强植物对包括盐胁迫在内的各种非生物胁迫的抗性方面发挥着重要作用。然而，BR在农业应用中存在局限性：土壤施用易被固定或流失，利用率低；作为内源激素易被代谢，作用持续时间短；过量施用反而会抑制植物生长。因此，亟需寻找适当方法来提高BR的利用效率和持效期。

另一方面，纳米技术为农业可持续发展提供了新工具。其中，介孔二氧化硅纳米颗粒（Mesoporous Silica Nanoparticles, MSN）因其结构可调、比表面积大、易于功能化、生物相容性好和成本效益高等独特优点而备受关注。MSN已被广泛用作农药纳米载体，以保护农药免受光解并延长害虫控制时间。此外，研究表明硅（Si）元素的补充有助于提高盐胁迫下植物的水分利用效率，从而促进植物生长。基于MSN和BR的特性，本研究提出一个可行性策略：利用MSN作为纳米载体负载BR，构建一种BR缓释剂系统（BR@MSN），以期协同发挥BR的生理调节作用和MSN的载体保护与硅元素补充作用，共同应对盐胁迫难题。本研究旨在开发一种新型BR@MSN缓释剂系统，并系统评估其对黄瓜种子和幼苗耐盐性的增强效果。

二、 详细工作流程

本研究流程主要包括纳米材料制备与表征、释放行为研究、以及对黄瓜种子萌发和幼苗生长的系列生物效应评估，共包含以下详细步骤：

1. 材料合成与制备： * MSN纳米载体的合成： 采用经典的溶胶-凝胶法。将模板剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶于乙醇水溶液中，加入氨水，在70℃下搅拌后，逐滴加入正硅酸乙酯（TEOS）作为硅源，反应24小时。通过离心、洗涤得到粗产物，最后用含盐酸的甲醇溶液洗涤以去除模板剂CTAB，干燥后得到纯化的MSN。 * BR缓释剂（BR@MSN）的制备： 采用溶液吸附法。将BR溶解在无水乙醇中配置成溶液，加入一定量的MSN纳米载体，在25℃下振荡24小时，使BR分子吸附并进入MSN的介孔孔道。随后离心分离，干燥沉淀物，即得到BR@MSN复合物。

2. 材料表征： * 化学结构确认： 使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对BR、MSN和BR@MSN进行分析，通过特征吸收峰确认BR成功负载到MSN上。 * 热稳定性分析： 使用热重分析（TGA）和微分热重分析（DTG）对比三者的热分解行为，通过BR@MSN在特定温度区间的额外重量损失计算BR的负载率（约3.61%），并观察BR分解温度的变化以评估热稳定性。 * 孔结构分析： 通过氮气吸附-脱附等温线测试，分析MSN和BR@MSN的比表面积、孔径和孔体积。结果表明负载BR后，平均孔径、比表面积和孔体积均略有下降，证实BR进入了孔道。 * 形貌与粒径分析： 使用扫描电子显微镜（SEM）观察MSN和BR@MSN的形貌（均为球形）和粒径（分别约为110 nm和120 nm）。并通过动态光散射（DLS）测定其在水溶液中的流体动力学尺寸（分别为203 nm和239 nm）。

3. BR@MSN的缓释行为研究： * 释放实验： 将BR@MSN置于透析袋中，浸入乙醇水溶液（60%）作为释放介质，在25℃下恒温振荡。在不同时间点取样，通过高效液相色谱（HPLC）测定释放介质中的BR浓度。 * 释放动力学拟合： 使用零级、一级、Korsmeyer-Peppas、Higuchi和Hixson-Crowell五种动力学模型对累积释放曲线进行拟合。根据回归系数（R²）判断释放行为最符合一级动力学模型，表明释放速率与BR浓度梯度密切相关。数据显示，BR@MSN在36小时内释放了约27%的BR，证明了其缓释特性。

4. BR浓度对黄瓜幼苗生长的影响评估（无盐胁迫条件下）： * 研究对象与处理： 黄瓜幼苗。设置不同浓度（0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L）的BR、MSN和BR@MSN处理组，每5天浇灌一次。 * 生长参数测定： 培养15天后，测量并统计幼苗的茎粗和根长。实验数据采用Duncan’s检验进行统计分析（p ≤ 0.05）。

5. 盐胁迫下种子萌发与幼苗生长评估： * 种子萌发实验： * 处理： 黄瓜种子经消毒后，用不同浓度的BR、MSN、BR@MSN溶液浸泡8小时，然后置于含150 mM NaCl溶液的萌发盒中。 * 观测： 在盐胁迫条件下培养3天和5天后，分别计算种子发芽率。 * 幼苗生长观察： 在处理后的盐胁迫条件下，直观观察并比较不同处理组黄瓜幼苗（特别是茎秆）的生长状态。

6. 叶面应用BR@MSN增强幼苗耐盐性的生理机制研究： * 处理： 选取具有三片真叶的黄瓜幼苗，将其第二片叶上滴加不同浓度的BR、MSN、BR@MSN分散液。24小时后，将幼苗根部转入120 mM NaCl溶液中进行盐胁迫处理24小时。 * 细胞活性与超氧阴离子检测： * 细胞活性（Evans Blue染色）： 取叶片用Evans Blue溶液染色，死细胞会被染成深蓝色，染色越深表明细胞损伤越严重，活性越低。 * 超氧阴离子积累（NBT染色）： 取叶片用氮蓝四唑（NBT）溶液染色，超氧阴离子（O₂⁻）会将无色的NBT还原为不溶性的蓝色甲臜沉淀，染色越深表明ROS积累越多。 * 抗氧化酶活性与膜脂过氧化产物测定： * 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定： 提取叶片酶液，采用核黄素-氮蓝四唑（NBT）光化还原法，通过测定其在560 nm处吸光度的变化来计算SOD活性。SOD是清除O₂⁻的关键抗氧化酶。 * 丙二醛（MDA）含量测定： MDA是膜脂过氧化的主要终产物，其含量可反映细胞膜受损程度。采用硫代巴比妥酸（TBA）法，通过测定溶液在450 nm、532 nm和600 nm的吸光度来计算MDA含量。 * 叶绿素含量测定： 采用丙酮提取法，通过测定提取液在645 nm和663 nm的吸光度，分别计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。叶绿素含量反映光合能力。

7. 叶面润湿性评估： * 方法： 使用接触角测量仪，测定水、BR、MSN和BR@MSN液滴在黄瓜叶片表面的接触角。 * 添加表面活性剂： 进一步评估添加0.05% Silwet L-77表面活性剂后，各液滴润湿性的改善情况。

三、 主要结果

1. 材料成功制备与表征确认： FTIR光谱中BR@MSN同时出现了MSN的Si-O-Si特征峰和BR的酯基、羟基等特征峰。TGA分析显示BR@MSN在428℃出现BR的特征分解峰，且负载率约为3.61%。氮气吸附结果表明负载BR后孔径减小。SEM证实颗粒呈球形，粒径约120 nm。所有表征均一致证明BR被成功负载到MSN孔道中，形成了BR@MSN复合物。

2. BR@MSN具有缓释特性： 释放曲线显示BR@MSN具有明显的缓释行为，前期快速释放表面吸附的BR，后期释放趋于平缓。一级动力学模型拟合最佳（R²=0.9970），表明其释放受浓度梯度驱动。这种缓释特性是避免BR初始浓度过高产生抑制作用的关键。

3. 无盐胁迫下BR浓度对幼苗生长的影响： 实验发现，单独使用BR时，低浓度（0.25 mg/L）促进根系伸长，但高浓度（2.0 mg/L）则显著抑制根系生长。而使用相同BR浓度的BR@MSN处理，即使在2.0 mg/L的高浓度下，幼苗根长仍能达到8.10 cm，比单独BR处理组增长了82.02%。这直接归因于BR@MSN的缓释作用，避免了BR的瞬时高浓度暴露。同时，MSN处理显著增加了茎粗，这得益于硅元素在细胞壁的沉积强化作用。

4. 盐胁迫下显著促进种子萌发和幼苗生长：

   • 种子萌发： 在盐胁迫下，单独BR处理在浓度超过0.25 mg/L时开始抑制发芽。而MSN和BR@MSN处理在所有浓度下均能提高发芽率。值得注意的是，在5天时，BR@MSN处理在2.0 mg/L浓度下的发芽率比相同浓度的单独BR处理提高了1324.29%。即使与单独MSN相比，BR@MSN也显示出优势，使发芽率提高了11.76%。这证明了BR缓释与MSN硅元素补充的协同增效作用。
   • 幼苗生长： 表型观察显示，BR@MSN处理能显著促进盐胁迫下黄瓜幼苗的茎秆伸长，且促进作用随浓度增加而增强，而单独BR在高浓度下则表现出抑制作用。

5. 叶面润湿性良好： 由于黄瓜叶片疏水，水、MSN和BR@MSN液滴的接触角约为90°。添加0.05% Silwet L-77表面活性剂后，BR@MSN液滴的接触角从90.58°降至44.5°，显著改善了其在叶面的铺展和滞留能力，有利于叶面吸收。

6. 叶面应用显著增强幼苗耐盐性及其生理证据：

   • 细胞活性与ROS积累： Evans Blue和NBT染色显示，盐胁迫（CK2）导致细胞活性严重下降，O₂⁻大量积累。BR@MSN叶面处理能显著减轻染色深度，且效果优于相同浓度的单独MSN或BR处理，表明其能有效维持细胞活力并减少ROS积累。
   • 抗氧化系统增强： 盐胁迫使SOD活性下降36.41%。MSN处理能提高SOD活性（2.0 mg/L时比CK2提高129.51%），而BR@MSN处理提升更为显著，使SOD活性比CK2提高了234.11%，极大增强了细胞的抗氧化防御能力。
   • 膜损伤减轻： 盐胁迫使MDA含量从2.42 μmol/g升至5.71 μmol/g。BR@MSN处理能有效降低MDA含量，在2.0 mg/L时降至2.21 μmol/g，比CK2降低了61.30%，表明细胞膜脂过氧化损伤得到有效缓解。
   • 光合色素得到保护： 盐胁迫导致总叶绿素含量大幅下降。BR@MSN处理能显著提升叶绿素含量，在2.0 mg/L浓度下，总叶绿素含量比CK2增加了110.88%，有助于维持光合作用。

四、 结论与价值

本研究成功开发了一种基于介孔二氧化硅纳米载体的油菜素内酯缓释剂系统（BR@MSN）。该系统粒径均一（约120 nm），具有显著的缓释行为。研究证实： 1. 应用价值： BR@MSN能有效增强黄瓜种子和幼苗的耐盐性。土壤应用可协同MSN的物理调节作用和BR的缓释生理调节作用，显著提高盐胁迫下的种子发芽率和促进幼苗生长。叶面应用则利用其良好的润湿性，通过增强抗氧化酶（SOD）活性、减少活性氧积累和膜脂过氧化产物（MDA）、保护光合色素等多重生理机制，全面提升幼苗的盐胁迫抵抗能力。 2. 科学价值： 本研究为克服植物激素在农业应用中利用率低、持效期短、易产生药害的瓶颈问题，提供了一种巧妙的纳米技术解决方案。它展示了将纳米载体（MSN）的控释特性、物理辅助功能（如供硅）与植物激素（BR）的生理活性相结合，实现“1+1>2”协同效应的可行性，为设计新型智能纳米农用化学品以应对非生物胁迫提供了重要借鉴。 3. 重要观点： 研究强调了“缓释”在激素类生长调节剂应用中的关键作用。单纯的BR高浓度暴露会抑制生长，而通过纳米载体实现可控释放，既能维持有效的生理刺激浓度，又能避免初始毒害，这是BR@MSN体系成功的关键所在。

五、 研究亮点

1. 创新性的策略： 首次将BR与MSN纳米载体结合，构建用于增强作物耐盐性的缓释剂系统，思路新颖，具有明显的学科交叉特色。
2. 系统的评价体系： 研究不仅评估了表型指标（发芽率、生长量），还深入探究了从细胞活性（染色）、抗氧化酶系统（SOD）、膜稳定性（MDA）到光合器官（叶绿素）等多个层次的生理生化响应机制，证据链完整，说服力强。
3. 明确的协同机制阐释： 研究清晰地区分并证明了MSN作为硅源和物理载体的作用，以及BR缓释的生理作用，并最终阐明了二者在提高耐盐性上的协同效应。
4. 兼顾施用方式： 研究了BR@MSN通过土壤施用和叶面施用两种途径的效果，并针对叶面施用评估了其润湿性能，使研究更贴近实际农业应用场景。
5. 方法严谨： 材料表征全面，释放动力学研究深入，生物实验设计合理并设置了充分的对照，数据分析采用统计检验，确保了结果的可靠性。