本文属于类型b，是一篇由Nature Reviews Methods Primers期刊于2025年发表的权威性方法学综述（Primer），题为“Interferometric scattering microscopy”。文章由加州大学伯克利分校的Naomi S. Ginsberg、台湾中央研究院原子与分子科学研究所的Chia-Lung Hsieh、牛津大学卡夫利纳米科学发现研究所的Philipp Kukura、捷克科学院光子学与电子学研究所的Marek Piliarik以及马克斯·普朗克光科学研究所的Vahid Sandoghdar等多位领域内顶尖学者共同撰写。该文系统梳理了干涉散射显微术（interferometric scattering microscopy，iSCAT）在过去二十年中从基础原理到前沿应用的发展脉络，为研究者提供了从实验搭建、信号处理到数据解读的完整指南。

本文的核心论点是：iSCAT作为一种无标记光学成像手段，通过检测亚波长物体的散射光与参考光束之间的干涉信号，实现了单分子水平的检测灵敏度，并在纳米粒子表征、三维追踪、细胞成像以及超快能量输运研究中展现出独特优势。文章围绕这一中心论点，从多个层面展开论证。

首先，在基础原理层面，文章阐明iSCAT的信号来源于散射场与参考场的相干叠加。当入射光与一个远小于波长的纳米物体相互作用时，物体被极化并产生散射场，其强度与物体极化率（polarizability）成正比，而极化率又与物体体积和介电函数密切相关。在检测端，散射场与参考场干涉后产生的强度调制中包含一个交叉项，该项正比于散射场振幅而非其平方，因此在瑞利散射（Rayleigh scattering）区间内，iSCAT的干涉信号随物体体积线性缩放，而暗场显微镜（dark-field microscopy）的直接散射强度则随体积的二次方缩放。这一标度关系使得iSCAT对小尺寸物体具有比传统散射成像高得多的灵敏度。文章进一步指出，在反射式共路径构型中，参考场与散射场经过几乎相同的路径，因此相位稳定，适合长期测量；而在透射式或外参考光束构型中，需要额外考虑相位稳定问题。此外，光源的纵向相干性和横向相干性均对干涉条纹质量产生决定性影响，文章对此进行了细致的理论分析。

其次，在实验装置与检测灵敏度层面，作者详细讨论了影响信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）的各因素。文章指出，iSCAT的检测极限最终受限于光子散粒噪声（shot noise），而提高入射功率、延长积分时间以及采用更大满阱容量的探测器是提升SNR的主要途径。同时，通过调节参考场强度可以改变对比度，例如在傅里叶平面放置小尺寸光束遮挡器，或利用抗反射涂层降低基底反射率，从而在不显著削弱散射信号的前提下增强干涉对比度。文章强调，尽管理论上降低参考场强度可以在散粒噪声极限下维持SNR不变，但在实际相机位数有限的情况下，适当调节参考场强度有助于充分利用动态范围。

第三，在信号处理与背景消除方面，文章系统介绍了几种关键策略。由于iSCAT对极微小的折射率差异和表面粗糙度均敏感，样品基底往往产生斑纹状（speckle-like）背景，其均方根对比度波动可达1%。为了从中提取目标信号，研究者发展了时间中值滤波、差分滚动平均、基于干涉点扩散函数（interferometric point spread function，iPSF）的定位与追踪、以及机器学习辅助检测等方法。其中，时间中值滤波适用于扩散中的粒子，通过计算每个像素在时间窗口内的中值来估计背景；差分滚动平均则用于检测蛋白质等分子在基底上的着陆事件，通过比较不同时间批次的平均帧来增强弱对比度信号。文章还特别介绍了频闪iSCAT（stroboSCAT），该方法通过比较有激发脉冲和无激发脉冲条件下的图像，分离出光生载流子或热效应引起的瞬态折射率变化，从而实现对固体材料中能量输运的超快成像。

第四，在单分子与单纳米粒子表征方面，文章展示了iSCAT在质量光度法（mass photometry）和干涉纳米粒子追踪分析（interferometric nanoparticle tracking analysis，iNTA）中的典型应用。iSCAT对比度与单个蛋白质的质量呈线性关系，这一线性标度使其能够快速测定溶液中蛋白质分子的质量分布，并已实现低于10 kDa的检测限。对于纳米粒子，iSCAT信号与粒径的立方根成正比，而通过轨迹扩散系数又可独立获得流体力学直径，两个正交参数的结合使得iNTA能够在二维散点图中分离具有不同尺寸和折射率的粒子混合物。此外，通过偏振分辨测量，iSCAT还可以提取各向异性粒子的取向信息。

第五，在活细胞成像应用方面，文章强调iSCAT与共聚焦检测相结合可以有效抑制离焦背景散射，进而实现活细胞内内质网小管、微管等纳米尺度结构的无标记成像。得益于干涉信号对轴向位置的相位敏感性，iPSF的三维特征使得研究者可以在几微米范围内追踪单个金纳米粒子标记的膜蛋白或病毒粒子，空间精度可达纳米级、时间分辨率可达微秒级。这种高速、长时程且不受光漂白限制的追踪能力为研究活细胞膜上的快速动态过程提供了独特工具。此外，瞬态iSCAT测量在半导体和二维材料中揭示了激子、电荷和热的输运行为，通过监测局域折射率变化，研究者可区分电子激发与热效应，并提取载流子扩散系数。

文章最后讨论了iSCAT的可重复性、局限性及优化方向。作者认为，由于信号缺乏本征的化学特异性，不同组成、尺寸和形状的粒子可能产生相似的对比度，因此需要结合偏振测量、光谱信息或动力学特征进行辅助判别。背景斑纹噪声和相位敏感性虽然可以被利用，但在密集样品中也会造成信号混淆。未来，探测器技术的进步、更完善的基底工程以及机器学习算法的发展有望进一步将蛋白质检测限推至1 kDa以下。整体而言，这篇综述的学术价值在于它为iSCAT技术提供了从光学原理、实验设计到数据分析的系统框架，促进了该技术在单分子生物物理、纳米计量学、活细胞成像以及固态材料科学中的跨学科应用。