主要作者及发表信息 本研究由印度科学及工业研究委员会-国家跨学科科学与技术研究所（CSIR-National Institute for Interdisciplinary Science and Technology）生物科学与生物工程部的Swati Pawar和Muthu Arumugam等人完成。通讯作者为Muthu Arumugam。该研究成果于2026年7月3日在线发表于期刊《Process Biochemistry》第168卷，页码为279至290。
研究背景与目的 微藻作为一种自养型生物细胞工厂，能够生产包括胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）在内的多种具有工业价值的生物分子，其生物活性和营养保健潜力备受关注。硒（Selenium, Se）是人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶等多种硒依赖酶的辅因子，对保护细胞免受自由基引起的严重氧化至关重要。将硒与多糖结合有望产生更强的生物活性。然而，传统的化学硒化方法常涉及苛刻的反应条件并产生环境污染物，而通过微生物培养进行生物转化则是一种可持续的替代方案。此前的相关研究集中于细菌和真菌，由于大多数藻类菌株无法耐受高浓度的无机硒，因此关于微藻硒多糖的研究尚属空白。本研究的目的是为了解决这一知识空白，利用一株通过专利生物过程开发的适应性进化微拟球藻菌株（Nannochloropsis oceanica CASA CC201，以下简称Nanno*），研究其将无机硒生物转化为含有机硒的胞外多糖（Se-EPS）的能力及其带来的结构和功能修饰。
研究工作流程详述 本研究的工作流程主要分为三个阶段：Se-EPS的制备与纯化、全面的结构表征、以及体外抗氧化活性评估。
第一阶段：含硒胞外多糖（Se-EPS）的制备与纯化。 研究设置了两个组别。对照组使用野生型微拟球藻（*Nannochloropsis oceanica*），在标准D-Walne培养基中培养，以生产普通胞外多糖（EPS）。实验组则使用通过适应性进化获得的专利菌株Nanno*（NCBI accession ID: MH398569），该菌株能耐受高达1000 µM的亚硒酸钠（Na₂SeO₃）。Nanno*菌株在添加了1000 µM亚硒酸钠的改良D-Walne培养基中，于相同条件下培养14天。培养结束后，将培养液在8000 rpm下离心15分钟，分离出生物质。收集的生物质用超纯水洗涤三次后，加入超纯水并在70°C下加热搅拌3小时，以提取胞外多糖。提取混合物再次离心，收集上清液。随后，向上清液中加入三倍体积的冰冷95%乙醇，在4°C下孵育过夜以沉淀多糖。沉淀物经离心收集、溶解后，用Sevag试剂（氯仿:正丁醇 = 5:1, v/v）反复处理三次以脱除蛋白。最后，水相部分再次用三倍体积的冷乙醇沉淀，离心收集沉淀并风干，获得纯化的胞外多糖。野生型菌株的产物命名为EPS，实验组Nanno*菌株的产物命名为Se-EPS。
第二阶段：全面的结构与化学表征。 该阶段运用了多种光谱、显微和生化分析技术对EPS和Se-EPS进行对比分析。 1. 紫外-可见光谱（UV-Vis）分析：将纯化的Se-EPS和EPS配制成5 mg/mL的水溶液，在190至600 nm范围内扫描。 2. 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析：取10 mg样品，在4000–400 cm⁻¹的频率范围内进行扫描，以检测官能团的变化。 3. 拉曼光谱（Raman Spectroscopy）分析：使用WITec alpha 300 R系统，以633 nm氦氖激光器在200–2400 cm⁻¹范围内采集光谱。 4. X射线光电子能谱（XPS）分析：使用PHI 5000 VersaProbe II系统，以单色化Al Kα辐射源进行分析，获取宽谱和高分辨率谱，研究Se-EPS的表面元素组成和化学键合状态。 5. X射线衍射（XRD）分析：使用Rigaku RINT 2000衍射仪（Cu Kα辐射，λ = 1.54 Å），在2°–70°的2θ范围内记录粉末样品的衍射图谱。 6. 核磁共振（NMR）分析：将10 mg Se-EPS在110°C下用2 M三氟乙酸（TFA）水解6小时，干燥后溶于氘代水（D₂O），使用Bruker Ascend 500 MHz NMR谱仪采集氢谱（¹H）、碳谱（¹³C）和硒谱（⁷⁷Se）。 7. 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析：通过微波辅助酸消解（EPA 3052方法）测定总硒含量；用15%盐酸提取样品进行分析无机硒含量，通过差值法计算有机硒含量。 8. 原子力显微镜（AFM）分析：用Bruker NanoScope V系统在轻敲模式下成像，分析粉末状Se-EPS和EPS的表面形貌、高度和粗糙度。 9. 单糖组成分析：将10 mg EPS进行TFA水解、干燥后，使用配备Rezex RPM-Monosaccharide Pb⁺²柱的高效液相色谱（HPLC）系统进行分析，通过与标准品的保留时间对比确定单糖组成。
第三阶段：体外抗氧化及自由基清除活性评估。 此阶段通过多种化学方法评估EPS和Se-EPS（浓度梯度为2, 4, 6, 8, 10 mg/mL）的抗氧化能力，以抗坏血酸作为阳性对照。 1. DPPH自由基清除实验：将样品与DPPH溶液反应，在暗处孵育30分钟后于517 nm处测吸光度。 2. ABTS自由基阳离子清除实验：使用市售试剂盒（Caymen, USA），按制造商指南进行分析。 3. 超氧阴离子（O₂•⁻）清除实验：在碱性二甲基亚砜（DMSO）体系中产生超氧自由基，通过其对硝基蓝四氮唑（NBT）的还原作用，在560 nm处检测吸光度。 4. 羟自由基（•OH）清除实验：采用2-脱氧核糖降解体系，反应后加入硫代巴比妥酸（TBA）并加热显色，在532 nm处测吸光度。 所有实验均进行三次重复，结果以平均值±标准差表示，组间显著性使用学生t检验分析。
主要研究结果详述 第一阶段研究成功从适应性进化的Nanno*菌株中制备出Se-EPS，为进一步分析提供了基础。
第二阶段的表征结果系统性地证实了硒的成功掺入及其对多糖结构的显著改造。 1. 光谱证据：UV-Vis光谱显示，Se-EPS在250–280 nm范围内的吸收峰强度增强，这归因于硒与多糖之间形成了Se-O键。FT-IR分析显示，Se-EPS除保留多糖特征峰外，在1400–1200 cm⁻¹区域的峰变得更尖锐、更强，且在870–820 cm⁻¹区域出现了归属于Se–O和C–Se伸缩振动的新谱带，同时~3400–3300 cm⁻¹的羟基峰减弱，表明羟基和羧基参与了硒的还原与稳定。拉曼光谱在633 cm⁻¹和456 cm⁻¹处出现新谱带，分别对应不对称的Se–O伸缩振动和C-O-Se振动。 这些光谱数据相互印证，直接证明了EPS基质中形成了新的含硒化学键，如C–O–Se和Se–O，而不仅仅是物理吸附。这为后续分析的定性提供了化学键合层面的依据。
元素与形态分析：XPS分析显示Se-EPS表面存在明显的Se 3d信号，其结合能为58.95 eV，该数值接近Se(IV)的范围，表明硒主要以氧化的有机硒形式存在，而非还原态或单质硒。ICP-MS定量分析是揭示硒生物转化效率的关键证据。结果显示，Se-EPS中的总硒含量为264.800 µg/g干重，远超EPS中的54.900 µg/g。更重要的是，Se-EPS中无机硒含量仅为7.916 µg/g，意味着高达97.01% 的硒以有机形式存在。 这一极高转化率不仅验证了XPS关于氧化态有机硒的推断，更定量地证明了Nanno*菌株将有毒无机硒高效转化为潜在更安全、更具生物活性的有机硒多糖的强大能力，是整个研究价值的技术基础。
结构与形貌变化：XRD图谱显示，Se-EPS与EPS具有相同的尖锐衍射峰，表明它们共享基本的晶体框架。但Se-EPS在2θ=34.14°处的衍射峰强度显著增强，其相对结晶度指数（CrI）从98.62%提升至98.98%，表明硒的掺入增强了多糖的结晶度或沿该晶面的择优取向。NMR分析提供了关键的分子结构信息。¹³C NMR谱确认了两种多糖的糖苷键均为α-构型，且糖环为吡喃型。Se-EPS的碳谱在126.35 ppm和117.92 ppm处出现了两个新的共振信号，这通常与不饱和碳或硒关联的碳环境有关。最具决定性的是⁷⁷Se NMR谱，在1290.08 ppm处观察到一个尖锐的共振峰，这是氧化的有机硒物种（如Se–O–C / Se–O）的特征信号。 这个信号首次在本研究体系内，于分子水平上直接证明了从无机亚硒酸盐到氧化有机硒化合物的成功生物转化，并嵌入到多糖水解物组分中。AFM形貌分析显示，从纳米尺度看，EPS的表面相对平滑，平均粗糙度（Ra）为24.2 nm；而Se-EPS表面出现不规则的圆形团块，高度可达138 nm（EPS为81.9 nm），Ra值显著增加至43.6 nm。这表明硒的掺入诱导了多糖链通过范德华力发生纠缠和聚集，形成了更为紧凑、粗糙的聚合结构。HPLC单糖组成分析表明，两种多糖的主要单糖均是葡萄糖，但Se-EPS中还出现了微量蔗糖、木糖和鼠李糖，其组成比例与EPS不同。
结构变化直接关联到第三阶段的功能活性提升。XRD揭示的更高结晶度、AFM揭示的更大表面粗糙度，以及NMR和XPS证实的氧化硒基团的存在，共同构成了Se-EPS抗氧化活性增强的结构基础。
第三阶段的功能评估结果明确显示，Se-EPS的抗氧化活性显著优于EPS。 1. DPPH自由基清除活性：Se-EPS表现出浓度依赖性的清除活性，在8 mg/mL时达80.37%，其IC₅₀值为4.35 mg/mL。在相同浓度下，其活性是EPS的1.45至1.96倍。 2. ABTS自由基清除活性：在8和10 mg/mL浓度下，Se-EPS的清除率分别为45.93%和49.38%，其活性是EPS的2.3至3.73倍，但IC₅₀值较高，为10.35 mg/mL。 3. 超氧阴离子清除活性：Se-EPS在10 mg/mL时清除率达65.70%，IC₅₀值为5.21 mg/mL，其活性是EPS的2.23至3.37倍。 4. 羟自由基清除活性：Se-EPS在10 mg/mL时清除率达50.04%，IC₅₀值为9.96 mg/mL，其活性是EPS的1.31至2.8倍。
结论与研究价值 本研究首次报道了利用适应性进化的专利微拟球藻菌株（Nanno*），在亚硒酸盐胁迫下生物合成含硒胞外多糖（Se-EPS）。研究明确证实，微藻具备将无机硒经生物转化为稳定的有机硒多糖的能力，该过程导致多糖的结构和功能发生显著修饰。掺入的硒主要以氧化有机硒（Se-O-C）形式存在，转化率高达97%。硒的掺入增强了多糖的结晶度和表面粗糙度，并赋予了Se-EPS显著增强的、剂量依赖性的体外抗氧化活性，这可能归因于硒的氧化还原活性中心与多糖官能团的协同作用。
科学价值在于填补了微藻领域硒多糖研究的空白，深入阐释了硒掺入与多糖结构、功能之间的构效关系，为理解其在预防氧化应激相关慢性疾病中潜在角色奠定了分子基础。应用价值在于，该研究提供了一种可持续、环境友好的途径来生产高生物相容性和生物活性的有机硒生物分子，突显了Se-EPS作为可持续营养保健品和功能性食品/饲料配料的巨大潜力。研究也为未来开展体内生物利用度、代谢命运、安全性和治疗功效评估指明了方向。
研究亮点 本研究的主要亮点包括：研究对象新颖，首次探索了适应性进化微藻的硒化胞外多糖。研究方法全面系统，整合了从紫外到核磁共振波谱、XPS、ICP-MS到AFM的跨尺度、多模态表征技术，特别是⁷⁷Se NMR的使用，为确认氧化有机硒物种的存在提供了决定性分子证据。关键发现突出，不仅揭示了97%的超高有机硒转化率，还清晰地描绘了硒化导致的多糖从分子尺度化学键合到纳米尺度表面形貌增粗，最终到宏观尺度抗氧化功能增强的级联效应，构建了完整的“结构-功能”关系链。