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本研究由Ryszard Korona、Cindy H. Nakatsu、Larry J. Forney和Richard E. Lenski共同完成，其中Ryszard Korona当时隶属于密歇根州立大学微生物生态学中心，并在研究期间同时受波兰雅盖隆大学环境生物学研究所支持；通讯作者为Richard E. Lenski。该论文发表于《Proc. Natl. Acad. Sci. USA》第91卷，第9037至9041页，1994年9月。
这项研究属于进化生物学与微生物生态学的交叉领域，其核心科学问题是自然选择过程中适应峰（adaptive peak）的多样性与可重复性。根据Wright提出的适应景观（adaptive landscape）理论，如果某一环境中存在多个适应峰，且不同适应峰被较低适合度的中间状态所分隔，那么初始相同的重复种群可能因随机突变、遗传漂变或历史偶然性而走向不同的进化路径；反之，如果适应景观只有一个可达的峰值，则重复种群更可能表现出平行进化。此前Lenski等人以大肠杆菌在葡萄糖限制的液体培养基中进行了长期进化实验，发现重复种群虽然并非完全一致，但在平均适合度和生活史性状上呈现较为相似的适应轨迹。然而，这一实验存在几个潜在限制：其一，所用菌株在实验室中已保存数十年，可能已经高度适应实验室条件，从而限制了进一步适应的幅度和方向；其二，液体培养基环境相对简单，可能只提供了少数适应方式，从而倾向于产生平行进化结果。
为了克服这些限制，本研究使用了一株新近从密歇根中部土壤中分离的细菌Comamonas sp. strain tfd41，并选择了2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）作为唯一碳源，以创造更大且更快速的适应空间。研究者设置了两种不同的选择环境：一种为物理上非结构化的液体环境，即mass-action环境；另一种为物理上结构化的琼脂表面环境，即structured环境。两种环境中的营养基础相同，种群大小和世代数也相同，但液体环境中细胞均匀悬浮于培养液中，而琼脂表面可形成碳源、氧气、湿度及代谢产物等多维空间梯度。实验共建立18个重复种群，均由单一祖先基因型出发，其中12个种群（6个链霉素抗性标记strr，6个萘啶酸抗性标记nalr）在液体环境中连续传代，6个种群（3个strr，3个nalr）在琼脂表面环境中连续传代。每48小时进行一次转移，每次转移约10^7个细胞，经历8次二分裂，即每2天约8代，共持续1000代。由于6个nalr液体种群在200至400代之间丢失了萘啶酸抗性标记，无法用于后续适合度测定，因此液体环境的适合度分析只包含6个strr种群，而结构化环境的6个种群均保留了标记。
在实验过程中，研究者首先观察了菌落形态多样性。他们发现三种稳定的菌落形态，即野生型、小菌落型和半透明型。这些形态差异具有遗传基础，且在200至1000代期间保持稳定。通过Shannon多样性指数对总多样性、群体内多样性和群体间多样性进行计算，结果显示结构化环境中的总菌落形态多样性在多数时间点显著高于液体环境。在群体内和群体间多样性方面，结构化环境也在多数采样点高于液体环境，但统计学显著性较弱。这表明结构化环境不仅促进了种群内部的表型多态性，还可能增加了重复种群之间的表型分化。
适合度测定采用与共同祖先进行竞争实验的方法。研究者将进化后的标记种群与未标记的祖先菌株混合，在同一环境中进行竞争，并根据两者的倍增次数比值计算相对适合度。由于链霉素抗性和萘啶酸抗性标记本身对适合度有轻微影响，实验结果分别按标记类型进行校正和分析。液体环境中的平均适合度轨迹显示，初始阶段适合度几乎没有变化，随后进入快速适应期，最后适应速度减缓。更重要的是，液体环境中6个重复种群适合度的标准差在前期增加，但在500代之后开始下降，至1000代时6个种群之间无显著适合度差异，说明这些重复种群在平均适合度上趋于收敛。相比之下，结构化环境中的适合度标准差持续增加，无论strr还是nalr种群，适合度与世代数之间均呈显著正相关，说明这些重复种群在进化后期仍然保持甚至扩大适合度分化。
为了进一步解析结构化环境中适合度变异的来源，研究者在500代和1000代时从每个种群随机选取4个克隆，并对每个克隆与祖先进行两次竞争实验。巢式方差分析表明，1000代时群体间方差分量显著大于群体内方差分量，说明适合度分化主要来自种群之间的遗传差异，而非种群内部克隆之间的差异。此外，500代与1000代之间各群体的适合度排序保持一致，strr和nalr两个独立标记组都出现相同排序的概率仅为0.028，这表明群体间适合度差异并非随机波动，而是在早期适应阶段就被固定下来，并在后续进化中得以维持。
为了排除适合度估计依赖于祖先作为参照系而可能造成的偏差，研究者还进行了进化种群之间的直接竞争实验。他们让来自strr种群的克隆与来自nalr种群的克隆相互竞争，并检验是否存在显著的竞争对象与相对适合度之间的交互作用。结果表明，无论是strr克隆还是nalr克隆，其与不同进化种群竞争时的相对表现均与它们相对祖先的适合度排序显著相关，且未发现明显的生态型间适合度排序倒转现象。这说明种群间适合度差异在不同参照系下具有一致性，支持这些差异代表真实且稳定的遗传分化。
论文的核心结论是：在营养基础相同但物理结构不同的环境中，重复种群的进化动态和分化程度存在显著差异。液体非结构化环境中的重复种群在平均适合度上表现出较强的平行性，而结构化环境中的重复种群则出现持续的适合度分化和更丰富的菌落形态多样性。研究者认为，空间结构化环境可能通过形成碳源、氧气、水分及代谢产物的局部梯度，促进不同基因型在不同微环境中的专化适应。如果这些适应之间存在权衡或冲突，那么单一基因型无法在所有方面都达到最优，从而使重复种群更可能到达不同的适应峰。换句话说，结构化环境可能增加了适应景观的崎岖程度，使多个适应峰同时可达，从而削弱了进化可重复性并促进了进化多样化。
该研究的重要价值在于，它以实验进化的方式提供了真实适应景观存在多个适应峰的经验证据。与理论模型不同，该研究通过控制初始基因型和环境条件，直接观测了重复种群在两种复杂程度不同的环境中的适应轨迹。其结果表明，环境结构的复杂性是影响进化可重复性的关键因素。这一发现对理解微生物适应、物种分化甚至病原菌在结构化生境中的进化都具有启发意义。此外，该研究还展示了如何利用微生物快速繁殖的特点，结合适合度竞争实验和克隆方差分析，来定量区分群体内与群体间的遗传变异来源。
本研究的亮点主要体现在以下几个方面。第一，研究对象为一株新分离的土壤细菌，并且以2,4-D为唯一碳源，提供了一个较具挑战性的代谢适应场景，有利于观察快速和大幅度的适合度变化。第二，实验设计同时包含非结构化和结构化两种环境，使研究者能够直接比较环境复杂性对进化分化的影响。第三，适合度测定不仅使用混合种群，还使用克隆和进化种群间的直接竞争，较为严谨地排除了参照系偏差。第四，研究发现结构化环境中的群体间适合度差异在早期阶段形成并在后期持续，这一时间动态为理解适应峰的固定过程提供了直接实验支持。
此外，论文还提到了一些值得关注的初步遗传学观察。例如，部分适应结构化环境的种群出现了分解代谢质粒上的大片段缺失，这些缺失并不影响2,4-D降解的结构基因；同时，所有18个种群中都独立出现了某个染色体片段的丢失。这些遗传变化在后续研究中可能有助于在分子水平上揭示适应峰形成的机制。
本研究通过长期的细菌实验进化，表明物理结构化的栖息地可以显著增强重复种群之间的进化分化，并在适合度层面提供了多适应峰存在的直接证据。这一工作为理解适应景观的结构、进化可重复性以及环境异质性在物种分化中的作用奠定了重要实验基础。