本研究由Francis Lim和David S. Peabody完成，通讯作者David S. Peabody来自美国新墨西哥大学医学院细胞生物学系及癌症研究与治疗中心。该研究于1994年发表在Nucleic Acids Research第22卷第18期，页码为3748至3752页。论文标题为《增加翻译阻遏蛋白对RNA亲和力的突变》。
本研究的学术背景是RNA噬菌体MS2的外壳蛋白（coat protein）的双重功能研究。MS2外壳蛋白既是病毒颗粒的主要结构蛋白，又是翻译阻遏蛋白（translational repressor），在感染周期中控制病毒复制酶（replicase）的合成。该蛋白通过结合一个RNA茎环结构（即翻译操纵子，translational operator）发挥功能，该结构包含复制酶的核糖体结合序列，同时也是基因组包装信号。外壳蛋白与RNA的特异性相互作用是研究RNA-蛋白质相互作用的理想模型。此前的研究已经确定了RNA和蛋白质在结合中的结构要求，并建立了一个双质粒系统用于鉴定RNA结合位点的氨基酸残基。在该系统中，一个质粒表达外壳蛋白，另一个质粒表达复制酶-β-半乳糖苷酶融合蛋白，通过检测融合蛋白的表达水平判断外壳蛋白的阻遏活性。
此前的研究中发现，大多数操纵子组成型（operator-constitutive，O^C）突变的抑制子（suppressor）同时存在衣壳组装缺陷，因此累积了更高水平的外壳蛋白二聚体（dimer），表现出超阻遏（super-repressor）表型。研究人员推测，超阻遏表型是由组装缺陷导致的阻遏形式（二聚体）浓度升高引起的，而非RNA结合更紧密。但其中一个突变体V29I在不影响病毒组装的情况下表现出超阻遏表型，提示其可能通过更紧密的RNA结合发挥作用。因此，本研究旨在分离和鉴定更多这类通过增强RNA结合能力而表现超阻遏表型的突变体。为避免再次分离到组装缺陷型突变体，研究者以FG环缺失突变体dlFG为起始材料进行进一步诱变。
研究的具体工作流程包括多个环节。首先，在突变体筛选阶段，研究者将dlFG突变体克隆到pUC118和pUC119载体中，制备单链DNA后，用亚硝酸、甲酸和肼进行随机化学诱变。互补链合成后，将外壳蛋白序列切下并重新克隆到pUC119中，构建突变文库。将该文库转化到含有pRZ6质粒的大肠杆菌DH5α菌株中，在含X-gal的LB平板上筛选白色或淡蓝色菌落。pRZ6含有在操纵子环中引入两个核苷酸替换的突变操纵子，该突变使其对阻遏具有抗性。选择白色或淡蓝色菌落后，对整个编码区进行DNA序列分析以确定核苷酸和氨基酸替换。随后通过定点诱变将每个突变引入全长（非dlFG）外壳蛋白序列中。
在蛋白质纯化阶段，野生型外壳蛋白和不影响组装的突变体按已有方法纯化。组装缺陷型突变体（即dlFG及其衍生突变体）则采用改进的方法纯化：细胞在LB培养基中生长至饱和后离心收集，冻融后用含溶菌酶的缓冲液重悬并裂解，经脱氧胆酸钠处理和超声破碎，用聚乙烯亚胺沉淀核酸，上清液用硫酸铵沉淀蛋白质，沉淀溶解后经Sephadex G-75凝胶过滤层析，再经S-Sepharose阳离子交换层析纯化，最后用Bradford法以鸡溶菌酶为标准进行蛋白质定量。
在RNA结合实验阶段，采用硝酸纤维素滤膜结合法（nitrocellulose filter-binding assay）测定蛋白质与RNA的亲和力。通过体外转录产生^32P标记的野生型操纵子RNA（rop5）和突变型操纵子RNA（rop6）。在蛋白质过量的条件下，将约10 pM的低浓度放射性标记RNA与不同浓度的外壳蛋白在TMKG缓冲液（含100 mM Tris-HCl、pH 8.5、80 mM KCl、10 mM乙酸镁、10%甘油和10 μg/ml BSA）中混合，0°C孵育1小时后通过硝酸纤维素滤膜，用液体闪烁计数测定滞留的复合物量。值得注意的是，研究发现dlFG蛋白在之前使用的TMK缓冲液（不含甘油）中表现出异常的双相结合曲线，而在加入10%甘油的TMKG缓冲液中该问题得到纠正。对照实验表明该浓度的甘油不影响野生型蛋白的RNA结合。
研究的主要结果包括以下内容。在突变体分离方面，获得了多个抑制O^C突变的突变体，包括之前已分离到的V29I以及新的K43R和K66R替换。V29I在X-gal平板上产生白色菌落，表明其高效阻遏；K43R和K66R产生淡蓝色菌落，提示其阻遏效率略低于V29I但优于野生型。
在RNA结合特性方面，滤膜结合实验表明dlFG蛋白与野生型蛋白的RNA结合行为无法区分，二者结合野生型操纵子rop5的解离常数（dissociation constant，K_d）均为3×10^-9 M，结合突变型操纵子rop6的K_d均为3×10^-7 M。这一结果与此前的论断一致，即dlFG的超阻遏表型是由组装缺陷本身引起的，而非RNA结合增强。
对于各点突变体，V29I-dlFG结合最紧密，对rop5的K_d为4×10^-10 M，对rop6的K_d为4×10^-8 M，比野生型蛋白对两种RNA的结合力均增强7.5倍。V29I-dlFG在蛋白质浓度高于10^-7 M时还表现出额外的RNA结合，研究者推测可能是V29I对RNA的非特异性亲和力增加所致。K43R-dlFG和K66R-dlFG的结合曲线彼此无法区分，对rop5的K_d为1×10^-9 M，对rop6的K_d为1×10^-7 M，虽然与野生型仅相差数倍，但在多次重复实验和不同蛋白质制备中均得到重现。
此外，研究者将V29I、K43R和K66R替换分别引入全长序列中，以检验FG环缺失是否影响RNA结合特性。结果表明，V29I和K43R在有无FG环缺失时的RNA结合行为相同，而K66R在FG环保持完整时对野生型RNA的结合与野生型蛋白一样，对突变型操纵子的结合增强也被消除。也就是说，K66R替换的效应在FG环完整时几乎消失。研究者解释，在野生型蛋白中，第66位残基的侧链从β-折叠的非RNA结合面伸出，因此预计不参与RNA结合；但在K66R-dlFG双突变体中，FG环从15个残基缩短为2个残基（Gly-Ala），可能导致多肽链的局部扭曲，使第66位残基能够参与结合位点。
研究结论指出，这些超阻遏突变体的氨基酸替换均位于此前鉴定的RNA结合位点之外。此前的研究表明RNA结合位点由β-折叠亲水面上交替排列的氨基酸残基组成，涉及每个单体中三条相邻β-链上的残基。本研究的超阻遏突变可能通过引入额外的RNA接触来扩展正常的结合位点。这可能是替换氨基酸残基与RNA之间形成新相互作用的直接效应，也可能是改变结合位点形状从而使未替换残基形成新接触的间接效应，还可能是消除了野生型复合物中不利接触的结果。此外，K_d值的改变幅度对应的自由能变化（ΔΔG）较小，例如V29I结合增强7.5倍对应的ΔΔG约为-1.1 kcal/mol，表明超阻遏是相对较弱的额外接触造成的。最后，突变体具有更高RNA亲和力这一事实说明，最大相互作用强度并不等同于最优强度。在RNA噬菌体的进化过程中，外壳蛋白与RNA的相互作用显然已被调谐到足够紧密以确保基因组包装，但又不过于紧密以免过早抑制复制酶合成。
本研究的亮点包括：成功分离了通过增强RNA结合能力（而非组装缺陷）实现超阻遏表型的外壳蛋白突变体；确定了V29I、K43R和K66R替换对野生型和突变型操纵子RNA的亲和力改变；揭示了K66R效应依赖于FG环缺失的结构背景；提出超阻遏突变通过扩展RNA结合位点表面来增强结合的模型。研究在方法上利用dlFG作为起始材料进行诱变，有效避免了组装缺陷型突变体的重复分离，这一策略具有创新性。此外，研究中发现dlFG在常规滤膜结合缓冲液中表现出异常结合行为，通过在缓冲液中加入甘油解决了该问题，这一方法学调整对于后续相关研究具有参考价值。