研究报告：优化基于自转运蛋白的酶表面展示技术于恶臭假单胞菌KT2440中

作者与机构： 本研究由Iasson E. P. Tozakidis, Lena M. Lücken, Alina Üffing, Annika Meyers 和 Joachim Jose* 共同完成。研究团队来自德国明斯特大学（Westfälische Wilhelms-Universität Münster）药物与药物化学研究所。该研究发表于 Microbial Biotechnology 期刊，于2020年出版（第13卷，第1期，第176-184页）。

学术背景： 本研究属于微生物技术与合成生物学领域，具体聚焦于“全细胞生物催化剂”的开发。恶臭假单胞菌（*Pseudomonas putida*）KT2440菌株因其代谢多样性、环境压力耐受性强以及培养要求相对较低等有益特性，被视为一种极具潜力的工业生物催化宿主。为了开发高效的全细胞催化剂，一种策略是将目标酶展示在细菌细胞表面，使其能够从细胞外部接触底物，同时保持与细胞的稳定连接。这种方法尤其适用于底物或产物不能透过细胞膜，或者酶本身需要膜环境的情况。

在革兰氏阴性菌中，表面展示可以通过单体自转运蛋白（Monomeric Autotransporter, Type Va）分泌途径实现。利用自转运蛋白展示重组酶的技术被称为“自动展示”（Autodisplay）。此前的研究团队已经成功在恶臭假单胞菌中利用自动展示技术展示了纤维素酶和半纤维素酶，用于全细胞催化降解生物质。在这些研究中，他们使用了一种名为“最大化自转运蛋白表达”（Maximized Autotransporter Expression, MATE）的质粒系统。该质粒编码的融合蛋白包含：N端的霍乱弧菌（*Vibrio cholerae*）CtxB信号肽（Signal Peptide, SP），随后是要展示的酶（乘客蛋白），以及C端的大肠杆菌（*E. coli*）EhaA自转运蛋白的转运结构域（Translocator Domain）。

尽管名为“自转运”，但已知该过程涉及多种细胞组分的参与，且存在物种特异性的相互作用。已有研究表明，异源自转运蛋白的表达和展示水平与宿主和供体物种之间的系统发育距离相关。此外，信号肽负责将蛋白质转运至细菌周质空间，其效率直接影响展示蛋白的量。因此，研究团队推测，优化信号肽和转运结构域这两个关键元件，可能有助于提高恶臭假单胞菌中自动展示的效率。

研究目标： 本研究旨在通过比较不同的信号肽和转运结构域，优化恶臭假单胞菌KT2440作为宿主菌的自动展示系统，以期获得更高活性的全细胞生物催化剂。

详细工作流程： 本研究主要包含两大核心实验流程：1）评估不同转运结构域对表面展示的影响；2）评估不同信号肽对表面展示的影响。研究以两种酶作为模型乘客蛋白：来自唐菖蒲伯克霍尔德菌（*Burkholderia gladioli*）的酯酶EstA和来自解糖热解纤维素菌（*Caldicellulosiruptor saccharolyticus*）的β-葡萄糖苷酶BglA。

流程一：评估不同转运结构域 1. 质粒构建： 研究团队构建了三种不同的质粒，其编码的融合蛋白均包含N端CtxB信号肽、带有6xHis标签的EstA酯酶，但具有不同的C端转运结构域。这三种转运结构域分别是： * MATE-EstA: 使用大肠杆菌EhaA自转运蛋白的完整转运结构域（包括β1-结构域、α-螺旋和β-桶状结构域）。此为对照标准构建体。 * MATE2-EstA: 将EhaA的α-螺旋和β-桶状结构域替换为来自恶臭假单胞菌KT2440自身EstP自转运蛋白的相应结构域（通过RaptorX软件建模预测其结构）。 * MATE3-EstA: 融合了EhaA的α-螺旋和EstP的β-桶状结构域。 所有构建体的β1-结构域均来自EhaA。将构建好的质粒分别转化到恶臭假单胞菌KT2440中，获得工程菌株。 2. 蛋白表达与细胞培养： 所有菌株在LB培养基中培养至OD578为0.5时，使用L-阿拉伯糖诱导融合蛋白表达2小时。设置未诱导表达的菌株作为阴性对照。 3. 流式细胞术分析： 为了检测酶是否成功展示在细胞表面，研究人员对表达后的细胞进行了免疫荧光标记和流式细胞术分析。具体步骤为：收获并洗涤细胞，先用鼠源抗6xHis一抗孵育，洗涤后再用DyLight 633偶联的二抗孵育。由于抗体分子过大无法穿透细胞膜，因此只有当目标蛋白（即融合蛋白的6xHis标签）暴露在细胞表面时，才能被抗体结合并产生荧光信号。通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度（MF），可以半定量地比较不同菌株表面展示的酶分子数量。 4. 全细胞酶活测定： 为了评估表面展示酶的功能性催化活性，研究人员进行了全细胞酯酶活性测定。将诱导表达后的细胞洗涤并重悬至标准OD值，与底物对硝基苯乙酸酯混合，在30°C下孵育。通过分光光度法在405 nm波长下监测反应产物对硝基苯酚的生成速率，从而计算酶活性（单位：mU mL⁻¹ OD⁻¹）。

流程二：评估不同信号肽 1. 质粒构建： 研究团队构建了另一组质粒，其编码的融合蛋白乘客蛋白仍为EstA酯酶，转运结构域固定为大肠杆菌EhaA的完整结构域，但N端信号肽不同： * MATE-EstA: 使用原有的霍乱弧菌CtxB信号肽（对照）。 * OprFSP-MATE-EstA: 使用恶臭假单胞菌自身外膜蛋白OprF的信号肽。 * EstASP-MATE-EstA: 使用铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）EstA自转运蛋白的信号肽。 同样，将这些质粒转化到恶臭假单胞菌中。此外，为了验证信号肽效果的普适性，他们以β-葡萄糖苷酶BglA作为第二个乘客蛋白，构建了包含CtxB信号肽（MATE-BglA）和OprF信号肽（OprFSP-MATE-BglA）的两种质粒。 2. 外膜蛋白分离与SDS-PAGE分析： 为了评估不同信号肽引导下融合蛋白在细菌外膜中的积累量，研究人员从诱导表达后的细胞中分离了外膜蛋白组分，并通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行分析。通过考马斯亮蓝染色观察目标融合蛋白条带的强度，可以直观比较不同信号肽介导的蛋白转运和插入外膜的效率。恶臭假单胞菌内源的外膜蛋白OprF（约35 kDa）被用作上样量内参。 3. 流式细胞术分析： 对表达不同信号肽-酯酶融合蛋白的菌株进行与流程一相同的流式细胞术分析，检测表面展示水平。 4. 全细胞酶活测定： 对表达不同信号肽-酯酶融合蛋白的菌株进行全细胞酯酶活性测定。对表达不同信号肽-β-葡萄糖苷酶融合蛋白的菌株，则使用底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，在55°C下测定β-葡萄糖苷酶活性。 5. 辅助生物信息学分析： 为了排除其他潜在影响因素，研究团队使用JCAT在线工具计算了CtxB和OprF信号肽编码序列的密码子适应指数（Codon Adaptation Index, CAI），并使用RBS Calculator预测了不同构建体的翻译起始速率，以评估密码子偏好性和mRNA二级结构对表达水平的潜在影响。

主要结果： 1. 转运结构域的影响有限： * 流式细胞术： 表达三种不同转运结构域（MATE-, MATE2-, MATE3-EstA）的菌株，其平均荧光强度（MF）均显著高于未诱导的对照，且数值相似（分别为1591, 1307, 1217）。这表明所有构建体均能成功将酯酶展示在细胞表面，且不同转运结构域对可检测的表面展示酶数量影响不大。 * 酶活测定： 与对照MATE-EstA（活性70 mU mL⁻¹ OD⁻¹）相比，使用恶臭假单胞菌EstP转运结构域的MATE2-EstA活性提高了44%（101 mU mL⁻¹ OD⁻¹），而混合结构域的MATE3-EstA活性（79 mU mL⁻¹ OD⁻¹）无显著提升。这些结果表明，更换转运结构域对全细胞催化活性的提升效果有限且不一致。 * 逻辑衔接： 这一结果提示，大肠杆菌EhaA转运结构域与恶臭假单胞菌周质伴侣蛋白的兼容性可能已经足够高，或者转运结构域的识别并非分泌机制的限速步骤。因此，研究重点转向了信号肽的优化。

2. 信号肽对展示效率有决定性影响： * SDS-PAGE分析： 在外膜蛋白样品中，均能观察到与预期分子量（~100 kDa）相符的蛋白条带，对应于去除了信号肽的融合蛋白。关键发现是，使用OprF信号肽的菌株（OprFSP-MATE-EstA）该条带最亮，而使用原始CtxB信号肽的菌株（MATE-EstA）条带最弱。这表明OprF信号肽能更有效地将融合蛋白转运并插入到恶臭假单胞菌的外膜中。 * 流式细胞术： 所有使用不同信号肽的菌株均显示表面展示成功。OprFSP-MATE-EstA菌株的平均荧光强度最高（MF=2064），显著高于CtxB信号肽菌株（MF=1591）和EstA信号肽菌株（MF=1035）。这进一步证实了OprF信号肽能带来更高的表面展示密度。 * 全细胞酶活测定（酯酶）： 信号肽的更换对酶活产生了巨大影响。使用OprF信号肽的菌株，其酯酶活性达到638 mU mL⁻¹ OD⁻¹，比使用原始CtxB信号肽的菌株（52 mU mL⁻¹ OD⁻¹）提高了超过12倍。EstA信号肽的活性（152 mU mL⁻¹ OD⁻¹）介于两者之间。 * 排除其他因素： 生物信息学分析显示，CtxB信号肽序列的密码子适应指数（CAI=0.54）高于OprF信号肽（CAI=0.35），且MATE-EstA的预测翻译起始速率也高于OprFSP-MATE-EstA。这排除了密码子偏好性或翻译起始效率导致OprF构建体活性更高的可能性，从而将活性提升归因于OprF信号肽更高的分泌效率。 * 普适性验证（β-葡萄糖苷酶）： 在第二个乘客蛋白BglA的实验中，观察到了类似的趋势。SDS-PAGE显示OprF信号肽构建体的外膜蛋白条带更明显。全细胞β-葡萄糖苷酶活性测定表明，使用OprF信号肽的菌株活性（181 mU mL⁻¹ OD⁻¹）是使用CtxB信号肽菌株（42 mU mL⁻¹ OD⁻¹）的4.3倍。这证实了OprF信号肽对自动展示的积极效果并非酯酶特异性，具有普适性，尽管效果大小可能因乘客蛋白而异。 * 副作用观察： 研究还注意到，所有表达自转运蛋白融合体的菌株对抗生素的敏感性增加，且菌落形成单位（CFU）下降了约1000倍。这可能是外膜中β-桶状蛋白数量增加对细胞膜完整性造成负担的结果。

结论： 本研究证实，在利用MATE系统于恶臭假单胞菌KT2440中进行自动展示时，融合蛋白跨内膜的运输步骤是效率瓶颈。该步骤的效率受信号肽的严重影响，而本研究所测试的几种转运结构域则影响有限。研究成功地将恶臭假单胞菌自身外膜蛋白OprF的信号肽应用于自动展示系统，并证明其能显著提高两种不同酶（酯酶EstA和β-葡萄糖苷酶BglA）的表面展示水平和全细胞催化活性。具体而言，使用OprF信号肽使酯酶活性提升了12倍以上，使β-葡萄糖苷酶活性提升了4倍以上。因此，OprF信号肽被确定为适用于恶臭假单胞菌自动展示的优化元件。

研究意义与价值： * 科学价值： 本研究深化了对自转运蛋白分泌机制，特别是在非模式宿主菌中应用时的限速步骤的理解。它强调了信号肽在异源蛋白表达和定位中的关键作用，尤其是在涉及跨膜转运的复杂系统中。 * 应用价值： 该研究为优化恶臭假单胞菌全细胞生物催化剂提供了直接、有效的策略。通过简单地将异源信号肽替换为宿主自身的高效信号肽（OprF SP），可以大幅提升表面展示酶的催化效率。这有助于推动恶臭假单胞菌在工业生物催化、生物修复、生物传感及活菌疫苗开发等领域的应用，特别是在需要酶暴露于细胞外环境的场景中。

研究亮点： 1. 重要发现： 明确鉴定出信号肽（而非转运结构域）是限制恶臭假单胞菌中基于MATE系统的自动展示效率的关键因素，并成功找到了一个能极大提升展示效率的宿主源信号肽（OprF SP）。 2. 方法新颖性： 研究采用了系统的比较方法，同时评估了转运结构域和信号肽的影响，并利用SDS-PAGE、流式细胞术和酶活测定等多种技术从蛋白积累、表面定位和功能活性三个层面进行综合验证。 3. 研究对象的特殊性： 聚焦于具有重要工业应用潜力的恶臭假单胞菌KT2440菌株，针对其优化自动展示技术，具有明确的指向性和应用前景。同时，使用两种不同性质的酶作为模型，增强了结论的可靠性和普适性。 4. 严谨的对照与分析： 通过生物信息学工具（CAI, RBS Calculator）排除了密码子使用偏好和翻译起始速率差异对结果的干扰，使结论更加坚实。

其他有价值的内容： 研究过程中观察到的工程菌对抗生素敏感性增加和存活率下降的现象，为未来实际应用提供了重要参考。它提示在构建高效表面展示菌株时，需要平衡表达水平与细胞活力/稳健性，可能需要通过启动子工程或诱导条件优化进行精细调控。此外，研究所建立的包含OprF信号肽的优化载体，为后续在恶臭假单胞菌中展示其他功能蛋白提供了一个强有力的通用工具平台。