本研究由西班牙巴塞罗那进化生物学研究所（Institut de Biologia Evolutiva (CSIC-Universitat Pompeu Fabra)）的Marc Abrisqueta、Songül Süren-Castillo和José L. Maestro*完成。通讯作者为José L. Maestro。该研究于2014年发表在《Insect Biochemistry and Molecular Biology》期刊第49卷上。

从学术背景来看，该研究隶属于昆虫生理学与分子生物学领域，特别是昆虫生殖发育与营养信号转导的交叉方向。昆虫的生殖过程，例如卵黄蛋白的合成及其调控的激素机制，需要消耗大量的能量和资源。机体如何感知自身的营养状态并据此调控生殖进程，是一个涉及代谢、内分泌、遗传和环境等多因素的复杂问题。已知营养信号的传递主要由两个进化上保守的通路负责：TOR（雷帕霉素靶蛋白）通路和胰岛素受体（Insulin Receptor, InR）通路。其中，InR通路在几乎所有后生动物中介导对营养水平的感知与响应。本研究以德国小蠊（*Blattella germanica*）为模型，旨在深入探究InR通路在连接营养状态与生殖过程，特别是保幼激素（Juvenile Hormone, JH）合成和卵黄原蛋白（Vitellogenin, Vg）生产中的具体作用。德国小蠊是一种具有“非自发性生殖”策略的原始不完全变态昆虫，即雌性成虫必须取食后才能启动生殖过程。其主要的促性腺激素是保幼激素，由咽侧体合成，它能激活脂肪体合成卵黄原蛋白，并促进卵母细胞将其摄取作为胚胎发育的储存蛋白。研究团队之前的工作已表明，在德国小蠊中，激活成虫雌性JH和Vg生产的营养信号至少部分由TOR通路介导。然而，InR通路在此过程中的具体角色和调控层级尚不清楚。因此，本研究的主要目标是阐明InR在感知个体营养状态、并调控JH合成与Vg生产过程中的功能及其作用层面。

研究的工作流程详尽，包含多个相互关联的环节。首先是德国小蠊胰岛素受体（BgInR）的克隆与序列分析。研究人员使用基于昆虫和脊椎动物InR保守序列设计的简并引物，以德国小蠊胚胎细胞系（UM-BGE-1）的cDNA为模板，通过RT-PCR获得了一个399 bp的假定BgInR同源片段。随后通过3’-RACE和多次5’-RACE技术，获得了全长4562 bp的cDNA序列（GenBank登录号: HG518668），编码一个1403个氨基酸的蛋白质。通过BLAST和Pfam数据库比对确认其为德国小蠊的InR同源物。序列分析显示BgInR具备典型的InR/IGF-IR蛋白结构域：两个配体结合域、一个弗林蛋白酶样半胱氨酸富集区、一个纤维连接蛋白III型结构域和一个蛋白酪氨酸激酶催化结构域。为了进行系统发育分析，研究人员选取了多种昆虫、蜱虫、线虫、文昌鱼及脊椎动物的InR/IGF1R序列，使用最大似然法构建了系统进化树。分析结果确认BgInR属于InR蛋白，并且其拓扑结构与物种进化关系基本一致，脊椎动物的胰岛素受体和IGF1受体在进化树中聚为一支，表明这两者在脊椎动物与无脊椎动物分离后才发生分化。

其次，研究人员分析了BgInR的表达模式。他们通过实时荧光定量PCR技术，检测了BgInR mRNA在成虫雌性第一个生殖周期中咽侧体和脂肪体中的表达水平。结果显示，在这两种组织中，BgInR mRNA水平在整个生殖周期内基本保持恒定。此外，比较了喂食和饥饿处理的5日龄成虫雌性中BgInR的表达。发现饥饿雌性的脂肪体中BgInR mRNA水平显著高于喂食组，而在咽侧体中则没有显著差异。

研究的核心部分是通过RNA干扰技术探究BgInR的功能。为了评估BgInR的功能，研究采用了系统性的体内RNAi方法。他们设计并合成了两种不同的双链RNA：第一种（dsInR）靶向BgInR蛋白酪氨酸激酶结构域的一部分（326 bp），第二种（dsInR-II）靶向纤维连接蛋白III型结构域的大部分区域（349 bp）。同时使用来自苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒多角体蛋白的非同源dsRNA作为对照。实验流程如下：在刚蜕皮的倒数第二龄（第五龄）若虫雌性腹部注射2 μg dsRNA，当其蜕皮进入最后一龄（第六龄）时，再次注射2 μg。随后在成虫蜕皮后第5天进行解剖和分析。为了排除发育效应，还在成虫期进行了RNAi实验：在卵鞘携带第一天注射单次2 μg dsRNA，12天后移除卵鞘以诱导第二个生殖周期，并在诱导后第5天解剖。在每个实验中，均通过RT-qPCR检测了目标组织（咽侧体、脂肪体）中BgInR mRNA的敲低效率，并评估了相关表型。

表型评估涉及多个方面：1) 发育表型：记录若虫蜕皮至下一龄期和成虫的时间，测量成虫前胸背板的长度以评估体型大小，并观察翅膀和翅盖的伸展情况。2) 食物摄入量测定：分别测量对照组和dsInR处理组个体在若虫期的干物质食物摄入量，以排除摄食差异对体型影响的干扰。3) 生殖相关表型：a) JH合成：通过体外培养咽侧体，并使用氚标甲基蛋氨酸掺入法，定量测定JH III的生物合成速率。b) JH合成通路基因表达：使用RT-qPCR检测咽侧体中JH合成关键酶（HMG-CoA合酶-1、HMG-CoA合酶-2、HMG-CoA还原酶、甲基法尼酯环氧化酶）的mRNA水平。c) 卵黄发生：检测脂肪体中卵黄原蛋白基因（BgVg）的mRNA水平，并测量基础卵母细胞的长度。

此外，为了探究InR通路是否独立于JH直接调控Vg合成，研究进行了脂肪体体外培养实验。取刚羽化（JH合成尚未激活）的成虫雌性脂肪体，先在Grace’s培养基中预培养30分钟，然后转移到含有或不含有PI3K特异性抑制剂LY294002（50 μM）的培养基中培养4小时，之后再转移到含有或不含有JH III（800 nM）的培养基中继续培养6小时。最后通过RT-qPCR检测BgVg mRNA的表达，以分析JH诱导的Vg转录是否依赖于PI3K（InR通路下游关键激酶）的活性。

最后，为了验证饥饿状态下脂肪体BgInR mRNA的上调是否由转录因子Foxo介导，研究人员对成虫雌性进行了BgFoxo的RNAi敲低实验（方法同前），并比较了喂食和饥饿状态下，对照组与dsFoxo处理组脂肪体中BgInR mRNA的水平。

研究的主要结果丰富且具有说服力。在BgInR表达分析中，确认了其在生殖周期中的稳定表达，并首次发现饥饿能特异性上调脂肪体（而非咽侧体）中的BgInR mRNA水平，这一增加在BgFoxo被敲低后消失，表明Foxo是饥饿条件下激活BgInR表达所必需的。

RNAi敲低BgInR产生了显著的发育缺陷。若虫期处理导致：1) 发育延迟：从倒数第二龄到最后一龄以及从最后一龄到成虫的蜕皮均显著延迟，累计延迟约2天。2) 体型变小：成虫前胸背板长度显著小于对照组。3) 翅畸形：约一半的处理个体出现翅盖无法正常伸展、后翅完全不能伸展的畸形表型。重要的是，食物摄入量测量显示，体型变小并非由于摄食减少，表明BgInR直接影响生长调控。

更重要的是，BgInR敲低强烈抑制了与生殖相关的生理过程：1) JH合成被严重抑制：成虫咽侧体体外合成的JH III量急剧下降。2) JH合成通路基因表达下调：咽侧体中HMG-CoA合酶-1、合酶-2、还原酶以及甲基法尼酯环氧化酶的mRNA水平均显著降低，降低幅度与饥饿雌性相似。3) 卵黄发生受阻：脂肪体BgVg mRNA水平大幅下降（减少80%，而饥饿组几乎检测不到），同时基础卵母细胞生长停滞，大小与刚羽化或饥饿雌性相当。这些表型精确地模拟了饥饿雌性的状态。使用第二种dsRNA（dsInR-II）重复实验，得到了完全一致的表型，排除了脱靶效应。在成虫期进行BgInR敲低，同样导致了JH合成通路基因表达下降、BgVg表达抑制和卵母细胞生长停滞，证明这些生殖表型是InR功能缺失的直接后果，而非发育缺陷的间接影响。

体外脂肪体培养实验揭示了调控层级的更多细节：JH III能有效诱导刚羽化雌性脂肪体表达BgVg，但当同时加入PI3K抑制剂LY294002时，这种诱导作用被完全阻断。这表明，JH对Vg合成的诱导作用依赖于完整的InR/PI3K信号通路活性，即营养信号通路与激素信号通路在此处交汇，InR通路是JH发挥其促卵黄发生作用的必要条件。

基于以上结果，本研究得出了明确的结论：在德国小蠊中，胰岛素受体（BgInR）信号通路是连接正向营养状态与生殖激活的关键桥梁。它通过直接调控咽侧体中JH合成通路关键基因的表达，来激活JH的生物合成；同时，该通路也是JH刺激脂肪体生产卵黄原蛋白所必需的。因此，BgInR的功能缺失会在JH合成和卵黄发生方面产生与饥饿处理相似的表型。这证实了InR通路在介导营养信号、从而激活昆虫生殖过程中的核心作用。研究也暗示，BgInR的敲低可能通过影响蜕皮激素的合成或信号转导（如导致翅畸形和发育延迟），但其在生长和发育中的具体作用需要进一步研究。

本研究的科学价值重大。首先，它在一个经典的昆虫模型（德国小蠊）中系统地阐明了InR通路在营养调控生殖中的双重作用：既调控促性腺激素JH的合成，又是JH执行其下游生殖功能（诱导Vg）的许可信号。这深化了我们对昆虫生殖-营养整合机制的理解。其次，研究揭示了营养信号通路的层级关系：TOR通路和InR通路共同介导营养信号，而InR通路的主要转录效应因子Foxo则在营养匮乏时发挥抑制作用。这种多通路、多因子协同调控的模式，反映了生物体精密适应环境资源变化的策略。从应用角度看，对昆虫InR通路的深入理解，可能为开发针对农业害虫或病媒昆虫的新型生育控制策略提供潜在靶点，通过干扰其营养感知与生殖的关联，达到种群治理的目的。

本研究的亮点突出：1) 研究设计系统全面：从基因克隆、表达分析到功能缺失表型鉴定（涵盖发育、生长、JH合成、卵黄发生等多个层面），并辅以体外机制探讨，逻辑链条完整。2) 技术方法可靠：采用了当时先进的系统性RNAi、实时定量PCR、体外器官培养和激素测定等技术，并通过两种不同的dsRNA验证了表型的特异性。3) 发现了重要的调控机制：不仅证实了InR对JH合成的调控，更重要的是通过体外实验揭示了JH对Vg的诱导作用依赖于InR/PI3K信号，这一发现对理解激素与营养信号通路的交叉对话（cross-talk）具有重要意义。4) 连接了生理与分子层面：将BgInR敲低导致的生理表型（JH合成减少、卵子不育）与特定分子（JH合成酶基因、Vg基因）的表达变化直接关联，提供了分子机制的解释。5) 验证了进化保守性：将德国小蠊的发现与果蝇、蚊子、赤拟谷盗等昆虫模型中的相关研究进行了对比和讨论，强调了InR通路在昆虫中功能的保守性，同时指出了不同昆虫（如完全变态与不完全变态）生殖调控策略的可能差异。

此外，研究中对Foxo在调节饥饿诱导的BgInR表达中作用的初步探讨，也为后续研究营养应激下基因表达调控的转录机制提供了线索。论文末尾提出的关于JH是否可能通过诱导胰岛素样肽来间接影响Vg合成的疑问，也为该领域的未来研究方向指明了道路。这项工作是昆虫内分泌学与信号转导领域一项扎实而深入的研究，为理解营养如何精准控制昆虫生殖周期提供了关键证据和理论框架。