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本研究的主要作者包括吴英煌（Yinghuang Wu）、王雪莹（Xueying Wang）、王浩宇（Haoyu Wang）、韩颖（Ying Han）、王雅萱（Yaxuan Wang）、邹春雨（Chunyu Zou）、朱健康（Jian-kang Zhu）和李明（Ming Li）。其中，朱健康和李明为通讯作者。研究由中国农业科学院作物科学研究所/国家南繁研究院、南方科技大学先进生物技术研究院及医学院等机构共同完成，并于2025年1月发表在《Plant Biotechnology Journal》上。
学术背景与研究动机
基因组编辑技术近年来取得了显著进展，特别是碱基编辑器（Base Editors, BEs）的开发，使研究人员能够在目标基因组位点实现单核苷酸水平的精确修改，从而促进植物功能基因组学研究和作物改良。目前，针对腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的直接编辑工具已在植物中得到了广泛应用，但针对胸腺嘧啶（T）的直接编辑工具仍然缺乏。最近，在哺乳动物细胞中开发了两种基于糖基化酶的无脱氨酶碱基编辑器：GTBE（用于T到S的直接编辑，S=G或C）和GCBE（用于C到G的直接编辑），实现了正交碱基修饰。然而，这些工具尚未在植物中应用。因此，本研究旨在开发一种适用于水稻的无脱氨酶T到G和C到K（K=G或T）碱基编辑工具，以扩展植物基因组编辑的能力。
研究方法与实验流程
本研究分为多个步骤，详细描述如下：
构建编辑器系统
研究团队通过将优化的人源尿嘧啶DNA糖基化酶变体（mhUNGv3 和 mhUNGv2）与Cas9切口酶（nCas9）融合，分别构建了PTGBE（T到G编辑器）和PCKBE（C到K编辑器）。mhUNGv3用于T到G编辑，而mhUNGv2则用于C到K编辑。每个构建体还包含一个双分核定位信号肽（NLS），以提高核内效率。
选择目标基因与实验设计
对于PTGBE，选择了水稻中的10个内源性位点（涉及5个基因）进行测试；对于PCKBE，则选择了8个内源性位点（涉及3个基因）。所有目标位点均经过精心设计，以评估编辑效率和窗口范围。
植物转化与编辑效率检测
通过农杆菌介导的水稻转化技术，获得了400株稳定转基因T0代植株（PTGBE实验）和255株T0代植株（PCKBE实验）。使用高通量测序（Hi-TOM）对编辑效率进行了分析。
数据分析与验证
数据分析包括编辑效率、编辑窗口范围、插入缺失（Indels）频率以及纯合突变、杂合突变、双等位基因突变和嵌合突变的比例。此外，研究团队还通过RT-PCR验证了PTGBE在调控可变剪接（Alternative Splicing, AS）中的应用。
主要结果
1. PTGBE的编辑效率与特性
PTGBE在水稻中的T到G编辑效率最高可达78.05%，平均效率为39.21%；相比之下，T到C的编辑效率较低（最高3.70%，平均2.93%）。编辑窗口范围为T2–T12、T14和T18，最佳编辑窗口位于T3–T5。此外，PTGBE在10个sgRNA靶点中诱导了20.00%至75.32%的Indels频率。
PCKBE的编辑效率与特性
PCKBE在水稻中的C到G编辑效率最高可达58.33%，C到T编辑效率最高为40.91%。编辑窗口范围为C2–C7、C9–C11、C13和C15–C16。PCKBE同样诱导了较高的Indels频率（13.04%至72.22%）。
PTGBE在可变剪接中的应用
PTGBE通过突变剪接供体（SD）或剪接受体（SA）位点成功调控了基因表达模式。例如，在OsARF24基因中，PTGBE诱导了第1内含子的保留，从而改变了mRNA的成熟形式。
特异性与安全性
使用Cas-OFFinder预测潜在的脱靶位点后发现，PTGBE和PCKBE的脱靶效应极低，仅在少数位点检测到编辑。
结论与意义
本研究成功开发了一种新型无脱氨酶碱基编辑器PTGBE和PCKBE，分别实现了水稻中T到G和C到K的高效编辑。这些工具极大地扩展了植物碱基编辑的应用范围，特别是在直接T编辑方面具有重要意义。此外，PTGBE还可用于调控可变剪接，为研究基因表达模式提供了新方法。尽管PTGBE和PCKBE诱导了较高的Indels频率，但未来可通过引入HMCES蛋白或Gam蛋白进一步优化其安全性。
研究亮点
1. 首次在植物中实现了高效的无脱氨酶T到G编辑。 2. 开发了新型C到K编辑工具，填补了植物碱基编辑领域的空白。 3. 通过调控剪接位点，展示了PTGBE在基因表达调控中的潜力。 4. 结合现有工具，可实现水稻中所有12种碱基转换。
其他有价值内容
本研究为植物基因组编辑提供了重要的技术突破，未来有望应用于作物改良和功能基因组学研究。同时，研究团队提出的技术优化方向（如引入HMCES和Gam蛋白）为后续研究奠定了基础。