针对气溶素家族新型纳米孔传感器的探索性研究学术报告

一、 研究团队与发表信息

本研究的主要作者包括Juan F. Bada Juarez, Nuria Cirauqui, Fernando Augusto T. P. Meireles, Louis W. Perrin, Julian Barry, Monika Bokori-Brown, Maria J. Marcaida, Chan Cao* 以及 Matteo Dal Peraro*。其中，通讯作者为Chan Cao（日内瓦大学）和Matteo Dal Peraro（瑞士洛桑联邦理工学院）。其他研究人员来自洛桑联邦理工学院、埃克塞特大学和日内瓦大学。这项研究成果以题为“Exploring New Nanopore Sensors from the Aerolysin Family”的研究文章形式，于2025年发表在学术期刊《Small》上（DOI: 10.1002/smll.202501219）。

二、 学术背景与研究目的

本研究隶属于生物纳米孔传感技术领域，具体聚焦于一类被称为气溶素样蛋白（Aerolysin-like proteins）的β-桶状孔形成毒素（β-pore forming toxins, β-PFTs）家族。气溶素（Aerolysin）是该家族的典型代表，因其具有明确的七聚体结构、长约10纳米且直径狭窄（约1.0纳米）的孔道、以及由精氨酸和赖氨酸残基形成的两个收缩区等特性，在DNA、肽段、多糖等生物分子传感与测序方面展现出巨大潜力。其长通道和窄收缩区可延长分析物（如单链DNA）的易位时间，有利于提高检测分辨率。

尽管气溶素样蛋白家族成员在单体状态下共享相似的结构折叠，但它们的序列同一性非常低，这给传统的序列比对带来了困难，从而限制了对不同成员孔道结构和特性的深入理解，也阻碍了基于理性设计发掘新型高性能纳米孔传感器的进程。因此，本研究旨在超越单一的气溶素蛋白，系统性地探索该家族中其他成员作为新型纳米孔传感器的潜力。具体目标包括：1）针对家族中三个已知单体结构但孔道结构信息有限的成员——产气荚膜梭菌ε毒素（Clostridium perfringens epsilon toxin, ETX）、硫色绚孔菌凝集素（Laetiporus sulphureus lectin, LSL）和苏云金芽孢杆菌副孢子蛋白-2（Bacillus thuringiensis parasporin-2）——构建并分析其寡聚孔道模型；2）通过计算机模拟（in silico）方法比较这些模型与气溶素孔道在几何、静电学、离子导电性及单链DNA（ssDNA）易位行为方面的差异；3）选取最具潜力的候选者（ETX）进行实验验证，通过单通道电生理记录（single-channel recording）表征其孔道特性及ssDNA易位能力。最终目标是为拓展和优化基于气溶素样蛋白的纳米孔传感平台提供新的候选分子和理论指导。

三、 详细研究流程

本研究采用了计算模拟与实验验证相结合的策略，工作流程可分为以下几个主要步骤：

1. 孔道结构建模与序列-结构分析： * 研究对象与建模基础： 研究选取了ETX、LSL和Parasporin-2三个气溶素样蛋白。它们均已有单体晶体结构（PDB ID: 1UYJ for ETX; 1W3A for LSL; 2ZTB for Parasporin-2），但完整的寡聚孔道结构未知（研究进行中，ETX的孔道结构PDB: 6RB9被发布并随后采用）。研究排除了与膜结合的结构域，仅聚焦于形成孔道的β-桶状区域。 * 建模方法： 由于序列相似性低，自动比对工具失效，研究首先进行了基于结构的手动序列比对。关键原则是：在单体结构中保留β2、β3链与β1、β4、β5链之间已存在的氨基酸相互作用，这些相互作用对形成最终孔道中的双β-桶折叠（double β-barrel fold）至关重要；在孔道的β-桶区域不允许引入缺口，长度差异仅允许存在于孔道顶部的胞外环区。完成比对后，使用MODELLER软件（v9.11），以已知的气溶素七聚体孔道结构（PDB: 5JZT）为模板，通过同源建模构建了ETX、LSL和Parasporin-2的七聚体孔道模型。ETX的实验结构发布后，直接使用其结构（6RB9）进行分析，验证了手动比对和建模的准确性。 * 结构特征分析： 对构建的模型和已知结构，分析了孔道内部的半径分布、静电势分布、孔道长度等物理化学性质。特别关注了保守的结构基序，如顶部的VPA基序、双β-桶折叠的稳定残基、孔道出口处一对保守的带电残基（K和E）以及由茎环滑动形成的“铆钉环”（rivet loop）的特性。

2. 计算机模拟分析孔道传感特性： * 模拟体系与方法： 使用GROMACS软件（2018版）进行分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟。将各蛋白孔道模型嵌入到1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）脂质双层膜中，并置于1.0 M KCl电解质水溶液环境中。系统经过能量最小化和分步平衡后，在施加150 mV跨膜电压的条件下进行250 ns的生产模拟。 * 分析内容： * 开放孔电流（Open Pore Current, OPC）估算： 通过分析模拟轨迹中离子（K+和Cl-）的位移，计算每种孔道的理论离子电流，并分别计算阴离子和阳离子的贡献。 * 离子密度分布： 计算K+和Cl-沿孔道轴向的密度分布，以理解离子选择性。 * ssDNA易位阻力评估： 采用牵引分子动力学（Steered MD, SMD） 模拟。将一个由4个脱氧腺苷酸（dA4）组成的单链DNA分子从孔道顶部（帽区）向底部（铆钉环方向）以恒定速度（0.004 nm/ps）牵引，记录牵引过程中所需的作用力，以此评估DNA穿越不同孔道不同位置时的能垒。 * 静电与选择性计算： 使用PBEQ服务器计算孔道的静电势，考虑脂质双层的存在。通过MD模拟数据估算孔道的离子选择性（阴/阳离子通透性比）和电渗流（Electroosmotic Flow, EOF）方向。

3. ETX纳米孔的实验表征： * 蛋白制备： ETX蛋白（UniProt序列Q57398，残基47-328）在大肠杆菌中表达，带有N端组氨酸标签，并通过镍柱纯化。使用胰蛋白酶-琼脂糖珠在4°C下处理2小时以激活毒素，使其具备寡聚化能力。 * 单通道电生理记录： 使用配备MECA-4芯片的Orbit Mini仪器（Nanion）进行实验。在芯片的微空腔上形成1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPhPC）脂质双层膜。电解液为10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 M KCl, pH 7.4。将激活后的ETX或野生型气溶素（作为对照）加入cis腔室。记录孔道插入事件和电流-电压（I-V）曲线以确定开放孔电流。 * ssDNA易位实验： 在形成稳定的单一孔道后，向cis腔室加入6 μM的dA4 DNA分子。在不同电压（80-160 mV）下记录电流信号。使用ClampFit和NanoLyzer软件分析事件，提取特征参数：阻断深度（Current Blockage，以开放孔电流的百分比表示）、停留时间（Dwell Time，即事件持续时间）和事件频率（Event Frequency）。通过分析这些参数随电压的变化趋势（例如，停留时间随电压升高而缩短是易位事件的标志），来区分DNA是易位通过孔道还是仅在孔道口碰撞/滞留。

四、 主要研究结果

1. 结构建模与比对揭示了家族的保守性与多样性： 手动序列比对和结构建模成功构建了LSL和Parasporin-2的孔道模型，并与后来发布的ETX实验结构高度一致，验证了方法的可靠性。分析发现，所有蛋白的孔道内部均富含丝氨酸、苏氨酸等亲水小残基。孔道出口附近的一对带相反电荷的残基（K和E）在气溶素、ETX、LSL和Parasporin-2中保守，但在更远的家族成员（如lysenin）中不保守。双β-桶折叠的稳定残基以及顶部的VPA基序和天冬酰胺残基在家族中高度保守，强调了该折叠对结构稳定性的关键作用。然而，“铆钉环”的极性和长度在不同成员间存在显著差异，气溶素、LSL和ETX的该环疏水，而Parasporin-2的带正电，这可能导致与膜相互作用的差异。

2. 计算机模拟预测了多样的孔道传感特性： * 几何与静电差异： 气溶素具有两个明显的收缩区（R220和K238处），半径最窄（~0.58 nm）。ETX在孔道入口处有一个主要收缩区（~0.75 nm，K108附近），且整个孔道内腔呈现强正静电势。Parasporin-2在孔道出口有一个收缩区（~0.80 nm），孔道静电性总体中性偏正，但入口区带负电。LSL则没有明显的狭窄收缩区，且孔道内腔呈强负静电势。 * 离子导电性与选择性： MD模拟估算的开孔电流显示，ETX和LSL的总电导高于气溶素，而Parasporin-2与气溶素相似。离子贡献分析表明，气溶素和Parasporin-2的电流主要由Cl-主导（阴离子选择性），而ETX和LSL的电流中K+贡献更大（阳离子选择性）。静电计算和离子密度图证实了这一点：气溶素为阴离子选择性（选择性~0.43），ETX和LSL为阳离子选择性（>2），Parasporin-2为弱阴离子选择性（~0.6）。相应的，电渗流方向也相反：气溶素为负向EOF（与阴离子运动方向一致），ETX和LSL为正向EOF。 * ssDNA易位阻力预测： SMD模拟显示，气溶素和ETX的最大易位阻力出现在孔道入口处，而LSL和Parasporin-2的最大阻力在出口处。ETX在入口处显示出最高的穿越能垒，Parasporin-2的能垒也较高（>400 kJ mol-1 nm-1），而LSL没有明确的强阻力点。

3. 实验验证揭示了ETX纳米孔的复杂行为与传感潜力： * 多构象孔道的发现： 实验发现ETX能自发形成三种具有不同开放孔电流（OPC）的稳定孔道类型，分别命名为Type I（~20 pA @ 100 mV）、Type II（~50 pA）和Type III（~60 pA）。这表明ETX可能组装成不同寡聚态（如七聚体、八聚体等）的孔道，其中Type III出现频率最高（44%）。而野生型气溶素仅观察到一种主要的孔道状态。 * ssDNA易位能力差异： 只有ETX Type III孔道能够有效易位dA4，其停留时间随电压增加而缩短，这是易位过程的典型特征。相反，Type II孔道中的dA4事件停留时间不随电压变化，且阻断深度较小，表明DNA分子未能易位通过，可能仅发生碰撞或滞留，这可能是由于Type II孔道直径过窄。 * 与气溶素的性能对比： 在高于100 mV的电压下，ETX Type III孔道中dA4的停留时间短于气溶素，这与模拟预测的ETX单收缩区、孔径较大的特性相符，使得DNA穿越更快。然而，ETX Type III对dA4产生的电流阻断深度显著大于气溶素，表明其可能对生物分子具有更高的检测灵敏度。但ETX捕获DNA的事件频率远低于气溶素。作者将此归因于两点：一是ETX孔道入口处存在带负电的E97残基环，对带负电的DNA产生静电排斥；二是ETX孔道入口的半径小于气溶素。这两者共同降低了DNA被捕获并进入孔道的概率。电渗流分析支持这一解释：气溶素的负向EOF有助于带负电的DNA进入孔道，而ETX的正向EOF则阻碍其进入。

五、 研究结论与价值

本研究成功探索了气溶素样蛋白家族中除气溶素外的三个成员作为新型纳米孔传感器的潜力。通过结合基于结构的手动序列比对、同源建模、分子动力学模拟和单通道电生理实验，研究得出以下核心结论：

1. 结构建模方法的有效性： 尽管序列相似性低，但基于结构保守性的手动比对结合同源建模，可以可靠地预测气溶素样蛋白的孔道结构，为发掘该家族其他未知孔道结构的成员提供了可行方法。
2. 家族内部的多样性是传感应用的宝藏： ETX、LSL和Parasporin-2在孔道几何、静电性质、离子选择性和电渗流方向上表现出显著差异。这种多样性意味着它们可能适用于传感不同类型的分子（如带不同电荷的分子、聚合物、肽段等），从而拓展纳米孔传感的应用范围。
3. ETX作为新型传感平台的独特性质： ETX不仅能形成多构象孔道，其Type III孔道在ssDNA易位中展现出更短的停留时间和更大的电流阻断深度，这分别有利于提高测序速度和检测灵敏度。虽然其DNA捕获频率较低，但这可通过工程化改造（如突变入口残基）进行优化，或将其优势转向传感带正电或中性分子。
4. 计算与实验的相互印证： 计算机模拟成功预测了ETX孔道的阳离子选择性、较高的开孔电导以及在入口处的高DNA穿越能垒，这些预测与实验结果（低捕获频率、快速易位）逻辑一致，验证了计算模拟在纳米孔传感器理性设计和筛选中的强大指导作用。

本研究的科学价值在于深化了对气溶素样蛋白家族结构与功能多样性的理解，并建立了一套从序列、结构到功能的系统性研究框架。其应用价值在于发现了ETX这一具有高灵敏度潜力的新型纳米孔候选材料，并阐明了LSL和Parasporin-2各自独特的电学特性，为未来开发针对特定分析物优化的下一代生物纳米孔传感器奠定了坚实基础。

六、 研究亮点

1. 研究对象的拓展与创新： 首次系统性地对气溶素样蛋白家族中多个非气溶素成员（ETX, LSL, Parasporin-2）进行并行的计算与实验研究，跳出了以往集中于单一气溶素蛋白的局限，开启了从“一个孔”到“一个家族孔库”的研究新思路。
2. 方法学的结合与验证： 创新性地采用了“结构引导的手动序列比对 + 同源建模 + 全原子分子动力学模拟 + 单通道电生理验证”的多层次研究策略。尤其是在低序列相似性下成功进行结构比对和建模，并通过后续发布的ETX实验结构得到了完美验证，证明了该计算流程的可靠性。
3. 意外的重要发现： 实验上首次观察到ETX蛋白可以形成三种稳定且电导不同的纳米孔构象，并明确只有其中一种（Type III）能够易位ssDNA。这一发现揭示了该家族蛋白在自组装和功能上的潜在复杂性，为理解孔形成机制和开发可控组装策略提供了新线索。
4. 对传感性能的深入机理阐释： 不仅比较了不同孔道的宏观传感性能（阻断深度、停留时间），还通过详细的静电分析、几何测量和电渗流计算，从物理化学原理层面深入阐释了性能差异的根源（如ETX入口负电荷环和较小孔径导致低捕获率，强正电性孔腔导致高阻断深度），实现了从现象到本质的关联。

七、 其他有价值的发现

研究还指出，孔道内腔的静电性质不仅影响离子电流，还直接关联到电渗流的方向，而电渗流方向是影响带电分析物（如DNA）捕获效率的关键因素之一。这一认识将离子选择性、电渗流和传感效率更紧密地联系起来，为未来设计具有特定目标分子捕获能力的纳米孔提供了更全面的理论考量维度。此外，对“铆钉环”多样性的观察提示，该结构域可能影响孔道在膜中的锚定和稳定性，是未来蛋白质工程改造的潜在位点。