本研究由舟山市农业科学研究院卢懋华、贺文韬、洪德成、付贤、虞梦艳、顾倩璐、姚金晓和杨飞等人完成，姚金晓与杨飞为共同通信作者。论文以网络首发形式发表于《分子植物育种》（Molecular Plant Breeding），网络首发日期为2026年7月29日。该研究属于植物分子生物学与观赏植物功能基因组学领域，核心工作是对马蹄莲（Zantedeschia aethiopica）八氢番茄红素脱氢酶基因（zapds）进行克隆、表达特征分析及生物学功能初步评估，并构建基于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）的病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）载体，为马蹄莲基因功能研究和观赏性状改良提供分子基础。

从学术背景看，类胡萝卜素是植物中一类重要的萜类色素，参与赋予花、果、叶丰富颜色，并在光合作用、光保护以及脱落酸等激素合成中发挥多重作用。在观赏植物中，类胡萝卜素合成调控是花色改良和品质提升的核心研究方向之一。八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase，PDS）是类胡萝卜素合成途径中的关键限速酶，催化八氢番茄红素转化为ζ-胡萝卜素。由于PDS功能保守且其基因沉默后常产生易于观察的光漂白表型，PDS基因在多种双子叶植物中已被广泛用作VIGS体系的内参报告基因。然而在单子叶观赏植物中，尤其是在马蹄莲中，PDS基因的分子特征及其作为VIGS报告基因的适用性尚缺乏系统评估。马蹄莲作为天南星科重要观赏花卉，其花色和叶色改良是育种研究的重要目标，但其遗传转化体系尚不成熟，功能基因组学研究相对滞后。VIGS技术因无需稳定遗传转化、周期较短，被认为是此类植物基因功能研究的有效工具。因此，本研究的目标是克隆马蹄莲zapds基因，分析其序列特征、蛋白结构和组织表达模式，并构建TRV介导的沉默载体，以评估其作为功能研究靶基因和VIGS报告基因的分子基础。

在研究流程上，本研究以白花马蹄莲为材料，首先利用PCR扩增获得zapds基因完整开放阅读框（ORF）序列，长度为1 731 bp，编码576个氨基酸。接着对该蛋白进行系统的生物信息学分析，包括分子量、等电点、亲水性、不稳定指数、信号肽、跨膜结构域、保守功能域、二级结构、三级结构、磷酸化位点和亚细胞定位预测。蛋白质分子量为65 kD，等电点为7.93，无信号肽，不稳定指数为43.73，属于不稳定蛋白，亲水性平均值为-0.048，属于亲水性蛋白。跨膜结构域预测显示其含有典型的NAD结合域和氨基氧化酶域。三级结构预测显示其与水稻PDS高度相似。亚细胞定位预测显示其主要分布于内质网和高尔基体，预测分值分别为0.540 3和0.387 6。在进化分析方面，研究构建了基于PDS蛋白序列的系统进化树，并进行多重序列比对，结果显示马蹄莲ZAPDS与油棕PDS亲缘关系最近，与石斛等单子叶植物聚类，而与番茄、拟南芥等双子叶植物相对较远；其与红掌、油棕等植物PDS氨基酸相似性约为80%，但在N端区域存在物种特异性差异。在表达特征分析方面，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测zapds在根、茎、叶中的表达水平，结果显示其在叶片中表达量最高，根中最低，且不同组织间表达差异显著，表明不同组织对类胡萝卜素合成需求差异较大。在VIGS载体构建方面，利用SGN-VIGS在线工具设计特异性引物，扩增zapds基因片段，使用EcoRⅠ和BamHⅠ对TRV2载体进行线性化，通过In-Fusion无缝克隆方法将目的片段连接至线性化载体并导入大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和双酶切验证，成功构建了基于TRV的zapds沉默载体。整个研究流程包括基因克隆、蛋白质生物信息学分析、进化与多重序列比对、组织表达模式分析和VIGS载体构建五个主要环节，研究对象为白花马蹄莲的根、茎、叶组织，每个组织样本在不同实验中用于RNA提取、cDNA合成、PCR扩增和RT-qPCR检测。

从结果看，zapds基因完整ORF的成功克隆和序列确认，为后续蛋白质结构和功能分析提供了基础。生物信息学预测结果表明ZAPDS蛋白具有PDS家族典型的结构特征，包括NAD结合域和氨基氧化酶域，三级结构与水稻PDS高度相似，支持其在类胡萝卜素合成通路中可能执行保守的酶学功能。亚细胞定位预测显示其可能定位于内质网和高尔基体，与传统认为类胡萝卜素合成起始于质体膜系统的认识存在差异。论文对此进行了讨论，认为这一差异更可能反映了在线预测工具在单子叶非模式植物中的算法局限性，而非真实的生物学定位差异。进化分析显示马蹄莲ZAPDS与单子叶植物PDS聚类，与油棕亲缘关系最近，说明其在进化上相对保守，但N端区域存在物种特异性差异，可能影响其调控特性。组织表达结果显示zapds在叶片中高表达，在根中低表达，与PDS在光合组织中承担类胡萝卜素合成和光保护功能的认识一致，说明该基因的表达模式支持其在马蹄莲光合组织中发挥重要功能。VIGS载体构建成功，说明zapds片段可以稳定整合至TRV系统中，为后续在马蹄莲中建立VIGS技术体系和进行基因沉默表型观察提供了实验材料。

本研究的结论是，马蹄莲zapds基因在序列结构、保守功能域和组织表达模式上均表现出与其他植物PDS基因的高度保守性，具备作为类胡萝卜素合成途径功能研究靶基因的分子基础。同时，成功构建的TRV-zapds沉默载体为在马蹄莲中建立VIGS体系提供了材料，提示zapds具有作为马蹄莲VIGS可视化标记基因的潜在应用价值。从科学价值看，该研究填补了马蹄莲PDS基因分子特征及其作为VIGS报告基因适用性评估的空白，为单子叶观赏植物功能基因组学研究提供了参考。从应用价值看，该工作为马蹄莲花色和叶色改良、类胡萝卜素代谢调控以及基于VIGS的基因功能快速验证提供了基础。论文还指出，未来研究需要系统优化单子叶植物VIGS侵染策略，如采用农杆菌浸润结合真空渗入法、使用单子叶植物强启动子驱动病毒载体等，并通过沉默后类胡萝卜素含量变化、光合参数和抗逆性表型等直接验证zapds的生物学功能。

本研究的亮点主要体现在三个方面：一是首次对马蹄莲zapds基因进行了从序列克隆到蛋白结构预测、进化分析和表达模式检测的系统研究；二是明确提出zapds作为马蹄莲VIGS报告基因的潜在价值，为单子叶观赏植物VIGS体系建立提供了新思路；三是研究讨论了亚细胞定位预测结果与经典认知的差异，并指出在线预测工具在单子叶非模式植物中的局限性，为相关生物信息学分析提供了方法学反思。此外，论文还提供了完整的引物序列和生物信息学分析所用在线工具网址，便于其他研究者重复和扩展相关工作。