研究论文报告

主要作者与研究机构

该研究的主要作者为王金林（Jinlin Wang）、段玉婷（Yuting Duan）、顾大鹏（Dapeng Gu）、李河娇（Hejiao Li）、雷洛（Luo Lei）、王宁（Ning Wang）等，通讯作者为刘海平（Haiping Liu）、周朝伟（Chaowei Zhou）和曾本和（Benhe Zeng）。研究机构包括西藏自治区农牧科学院水产科学研究所（Institute of Fisheries Science, Xizang Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences）、西南大学西部（重庆）科学城种质创制大科学中心（Integrative Science Center of Germplasm Creation in Western China）、西南大学水产学院（College of Fisheries, Southwest University）以及西南大学药学院（College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University）。该论文发表于 *Marine Biotechnology*，2026年第28卷，文章编号117。

研究背景

活鱼运输是当代水产养殖体系中不可或缺但要求极高的环节，涉及苗种分发、商品鱼上市运输及增殖放流等多个生产阶段。运输过程中，鱼类面临拥挤胁迫、水质波动、机械振动和温度变化等多重应激源，其中高密度拥挤和水质恶化是主要应激驱动因素。不当的运输操作会加剧水质恶化，造成过度生理应激，降低苗种质量，损害商品鱼产品品质，甚至导致存活率下降和重大经济损失。运输应激不仅扰乱代谢稳态、引发行为异常，还损害免疫能力和生长性能。

怒江裂腹鱼（*Schizothorax nukiangensis*）隶属鲤形目鲤科，是中国怒江（萨尔温江流域）中上游特有的珍稀鱼类。其广泛的海拔分布和对高海拔环境的显著生理适应使其成为研究高原淡水鱼类适应机制的理想模型。然而，由于过度捕捞、水电开发和栖息地退化，怒江裂腹鱼野生种群已显著衰退。为此，西藏已启动人工驯养和增殖放流工作，而活鱼运输是保护实践和科学研究中不可避免的环节。在可控的运输因素中，装载密度对运输结果—尤其是短途运输—起着关键作用。迄今关于怒江裂腹鱼的研究主要集中于基础生物学、种群遗传学和适应性进化等方面，运输应激生理学研究几乎空白。鳃和肝脏作为呼吸和代谢调节的主要器官，是运输应激的主要靶器官。鳃作为直接接触外部环境的第一屏障，最先感知运输引起的水质恶化和拥挤应激；鳃损伤进而引发全身应激级联，迫使肝脏——代谢和解毒中枢——动态动员能量储备并启动代谢重塑。因此，对鳃和肝脏进行整合分析对于揭示怒江裂腹鱼密度依赖性运输应激的整体生理和分子网络至关重要。本研究旨在通过整合水质参数测定、血浆生化指标检测、鳃和肝脏组织学评估以及转录组学分析，评估不同运输密度（D1 = 100 kg/m³，D2 = 150 kg/m³，D3 = 200 kg/m³）在4小时运输后对怒江裂腹鱼的影响，阐明运输应激的生理和分子机制，并为优化该高原特有物种的运输策略提供理论支持。

研究流程

实验所用怒江裂腹鱼来自中国华电西藏大古水电站鱼类增殖站，平均体重162.4 ± 2.56 g。实验经西南大学实验动物管理与使用委员会批准（批准号：IAC2025-1–0345）。实验设置了常规养殖条件下的空白对照组（CO）和三个密度处理组（D1、D2、D3），每组三个重复袋。运输前禁食24小时，将鱼放入充氧尼龙运输袋（51 cm × 98 cm），水鱼体积比约为3:1。密封前注入纯医用氧气（99.9%纯度），维持充气气体与水的体积比约2:1。密封袋置于机械模拟运输振动平台（WSZ1-100，上海仪器有限公司）上，以100 r/min 振动4小时模拟运输过程。

运输结束后，立即使用AZ86031水质分析仪（AZ Instrument Corp.，广东，中国）测量水温和pH，收集500 mL水样采用气相分子吸收光谱法（HJ 195–2023）测定氨氮浓度。记录死亡个体用于死亡率统计，选取存活且状态良好的鱼进行采样，每袋3尾、每组共9尾，经40 mg/L MS-222麻醉1分钟后，从尾静脉采血至EDTA抗凝管，4°C暂存。随后立即解剖取鳃和肝脏组织，部分组织固定于4%多聚甲醛用于组织学处理，其余样品放入无RNA酶冻存管中液氮速冻，–80°C保存用于转录组测序。每个处理组的3个袋内样品分别混合形成3个生物学重复（n = 3），用于后续生化分析和转录组测序。

组织学分析：鳃和肝脏组织在4%多聚甲醛中固定24小时后，经梯度乙醇脱水（70%、80%、90%、95%、100%）、二甲苯透明、石蜡浸蜡包埋，使用手动轮转切片机（Leica RM2235，美国）切成6 μm切片，苏木精-伊红染色，中性树胶封片，在正置光学显微镜（Nikon Eclipse Ni-e，日本）下观察和成像。

血浆生化指标：血样于4°C放置2小时后5000 rpm离心15分钟，取上清测定活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）、皮质醇（COR）、葡萄糖（GLU）和免疫球蛋白G（IgG）。全部使用上海ZCibio科技有限公司商业试剂盒，在酶标仪（Epoch-SN，Gene Company Limited，中国）上读取吸光度。

转录组分析：使用FastPure细胞/组织总RNA分离试剂盒V2（Vazyme，南京，中国）提取鳃和肝脏总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性和浓度。cDNA文库构建和测序由广州Gene Denovo生物技术公司完成，使用Illumina NovaSeq 6000平台。原始读段经Fastp（v0.18.0）过滤获得高质量clean reads，计算Q20、Q30和GC含量评估测序质量。使用HISAT v2.1.0将clean reads比对到怒江裂腹鱼参考基因组（国家基因组数据中心，登录号：GWHGEXO00000000.1），利用Cuffdiff中的FPKM法量化基因表达水平，DESeq2进行差异表达分析。差异表达基因（DEGs）筛选标准为|log2 fold change| ≥ 2且错误发现率（FDR）< 0.05。随后进行KEGG和GO富集分析，p < 0.05且校正q值 < 0.05视为显著富集。为验证转录组结果，从每个实验组随机选取5个DEGs进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证，以β-actin为内参基因，使用2⁻ΔΔCt法计算相对表达量，引物由Primer Premier 5.0设计、华大基因合成。

统计分析使用SPSS 26.0进行，数据以均值±标准差表示。正态性和方差齐性分别采用Shapiro-Wilk和Levene检验，方差齐性数据采用单因素方差分析（ANOVA）及Duncan多重比较，方差不齐时采用Welch’s ANOVA及Dunnett’s T3事后检验，不同字母表示p < 0.05显著差异。图表使用GraphPad Prism 9.5和Microsoft PowerPoint生成。

主要研究结果

水质参数方面：与对照组相比，各密度组水温显著升高，且随密度增加呈明显上升趋势（p < 0.05）；pH值在所有密度处理组均显著下降（p < 0.05）；氨氮浓度在D1–D3组均显著升高（p < 0.05），在D2组达到峰值。最高密度组（D3）出现死亡，存活率降至98.33%。这些结果表明，运输密度增加导致封闭运输体系内水质迅速恶化：鱼类呼吸产生的CO₂溶解导致pH下降，代谢废物和排泄物积累推高氨氮浓度，高密度拥挤加剧了这些负面效应。

组织形态学方面：对照组鳃结构完整，鳃小片排列有序，氯细胞、黏液细胞和血细胞分布正常，上皮层连续无肿胀。D1组出现数个次级鳃小片基部局部肿胀；D2组损伤加剧，鳃小片基部和顶端均出现明显肿胀，伴随鳃小片缩短、上皮增生和相邻鳃小片部分融合；D3组病变最严重，表现为鳃丝顶端和基部显著肿胀、鳃丝广泛弯曲、多个鳃小片融合或变形以及局部上皮脱落。肝脏方面，对照组肝细胞呈清晰的多边形形态，细胞质均匀，圆形细胞核居中；D1组肝细胞出现早期空泡变性，部分细胞核向细胞周边移位；D2组肝细胞空泡化显著，细胞边界模糊，核溶解或缺失明显；D3组表现为肝血窦明显扩张、中央静脉周围血细胞聚集、广泛核降解、严重胞质空泡化甚至部分肝细胞胞质破裂。这些组织学损伤呈明显的密度依赖性加重趋势，表明高密度运输对鳃的呼吸交换功能和肝脏的代谢解毒功能造成进行性结构破坏。

血浆生化参数方面：与对照组相比，ROS和皮质醇水平在所有密度处理组均显著升高，在D3组达到最高值（p < 0.05）；SOD活性也呈显著的密度依赖性升高（p < 0.05）；CAT活性和T-AOC在D1和D2组显著高于对照组（p < 0.05），但两指标从D1到D3逐渐下降，D3组的CAT活性降至对照组以下（p < 0.05），而T-AOC在D3组与对照组无显著差异（p > 0.05）；葡萄糖浓度在所有密度处理组均显著升高（p < 0.05），在D1组达到峰值；IgG水平在所有密度处理组显著降低（p < 0.05），D3组最低。这些结果揭示：运输应激激活了抗氧化防御系统，但高密度胁迫超出了机体的保护能力，导致氧化还原失衡和免疫抑制。皮质醇和葡萄糖的升高反映了应激状态下能量动员的典型反应，而IgG的下降初步表明运输应激显著损害了怒江裂腹鱼的免疫功能。

转录组学方面：鳃组织中共鉴定出11,279（C-G vs D1-G）、10,661（C-G vs D2-G）和11,713（C-G vs D3-G）个DEGs，其中下调基因数分别为6,857、6,125和7,157，上调基因数分别为4,422、4,536和4,556。肝脏组织中共检测到5,555（C-L vs D1-L）、5,402（C-L vs D2-L）和5,880（C-L vs D3-L）个DEGs，其中下调基因数分别为2,273、2,167和3,147，上调基因数分别为3,282、3,235和2,733。KEGG富集分析显示，DEGs主要富集于代谢、免疫和应激信号相关通路。鳃中，D1组DEGs显著富集于TNF信号、破骨细胞分化、坏死性凋亡、胞质DNA感知通路、C型凝集素受体（CLR）信号和Toll样受体（TLR）信号等通路；D2组富集于碳代谢、内质网蛋白加工、甘油脂代谢、类固醇生物合成、抗原加工与呈递、IL-17信号和TLR信号等；D3组富集于DNA复制、核苷酸代谢、类固醇生物合成、胞质DNA感知通路、抗原加工与呈递、脂肪酸代谢和坏死性凋亡等。肝脏中，三个密度组的DEGs均显著富集于类固醇生物合成、PPAR信号、丙酮酸代谢、胰腺分泌、脂肪消化吸收、磷酸戊糖途径和甘油脂代谢等通路。

趋势分析（C-D1-D2-D3）显示，鳃中呈持续上调趋势的DEGs（profile 9）富集于胰腺分泌、抗原加工与呈递、蛋白质消化吸收、甘油脂代谢和内质网蛋白加工通路；呈持续下调趋势的DEGs（profile 0）主要富集于核苷酸代谢、嘧啶代谢、RIG-I样受体（RLR）信号、IL-17信号、胞质DNA感知、氧化磷酸化和Toll/IMD信号通路。免疫相关通路的代表性基因热图显示：HSP70、HSP90AB1、HSPA5、PDIA3、MHC1、TAPBP、B2M、MHC2、HLA-DPA1和HLA-DRA等抗原加工与呈递相关基因显著上调；而CGAS、STING、TBK1、IRF7、MYD88、TLR3、TRIF、IFAK4、CLEC4L和CARD9等先天免疫或核酸触发免疫信号相关基因显著下调。这一协调的转录响应模式表明，运输密度增加抑制了先天免疫应答，同时通过抗原加工与呈递通路增强了适应性免疫的激活。肝脏中，持续上调的DEGs富集于PPAR信号、脂肪酸降解、类固醇生物合成、脂肪消化吸收、甘油脂代谢和糖酵解/糖异生等通路；持续下调的DEGs富集于氨酰-tRNA生物合成、剪接体、蛋白酶体、氨基酸生物合成、内质网蛋白加工和磷酸戊糖途径等。值得注意的是，PPAR信号通路在运输应激后的肝脏中发挥核心调节作用。随着运输密度增加，NR1C2、NR1C3、RXRA、RXRB、FABP3、SLC27A1、ACSL、CPT1A、CPT2、SCP2和ACOX2等PPAR通路关键基因逐步上调。这表明肝脏通过激活PPAR信号促进脂肪酸转运、降解和β-氧化，维持运输应激条件下的能量供应。同时，PEPCK和甘油激酶等糖异生关键基因也上调，实现了脂质-葡萄糖代谢的协同调控。

结论与意义

本研究系统揭示了运输密度对怒江裂腹鱼生理和分子响应的深远影响。高密度运输引起水质恶化、氧化应激和免疫抑制，同时造成鳃和肝脏的显著组织病理损伤。转录组分析表明，密度增加抑制了先天免疫通路（包括RIG-I样受体信号、IL-17信号和胞质DNA感知通路），同时上调了抗原加工与呈递通路，表明免疫调控向增强适应性免疫激活方向转变。鳃和肝脏均表现出脂质代谢相关通路的显著富集，伴随PPAR信号通路的激活，促进脂肪酸转运、降解和β-氧化，以维持运输应激下的能量供应。这些发现揭示了运输应激下代谢和免疫过程的双重调控机制，为优化怒江裂腹鱼的运输密度和改善该高原特有鱼类的福利管理提供了重要依据。

研究亮点

本研究的创新之处在于：（1）首次对怒江裂腹鱼这一高原特有珍稀鱼类的运输应激生理学进行了系统研究，填补了该物种运输应激研究空白；（2）采用整合分析方法，将水质参数、血浆生化指标、组织病理学和转录组学数据有机结合，从宏观到分子层面全面解析了密度依赖性运输应激的生理和分子网络；（3）揭示了一个新颖的免疫调控模式：运输密度增加抑制先天免疫通路而增强抗原加工与呈递通路，表明先天免疫与适应性免疫之间存在动态平衡的转换；（4）阐明了PPAR信号通路在肝脏脂质代谢重塑中的核心调控作用，为理解鱼类运输应激下的能量代谢适应提供了分子证据。此外，研究还存在一定的数据不足，缺乏动态溶解氧数据和运输后恢复阶段数据，未来研究有必要纳入这些因素，以深入探索该物种在运输应激下的组织修复动力学和健康恢复状态。