本研究由沈阳农业大学的张亚婷、张宁、张志勇、毕欣悦等研究人员，与辽宁东亚种业有限公司的冯振强、郭艳玲，以及辽宁大学的缪建家等合作完成，于2025年12月19日在《microbiological research》期刊在线发表，卷期号为第305卷（2026年），文章号为128430。
研究背景与目的
干旱胁迫严重制约全球农业生产力和粮食安全。利用有益的植物-微生物互作来提升作物抗逆性是一个前景广阔的策略，其中植物根际促生细菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria， PGPR）发挥着重要作用。已知PGPR可通过多种机制增强植物抗旱性，包括调节植物激素平衡、增强抗氧化防御系统和促进养分吸收等。在各类PGPR中，芽孢杆菌属（Bacillus）因效果显著而被广泛认可，其形成稳固生物被膜（biofilm）的能力被认为是成功定殖根部及适应胁迫的关键。生物被膜作为一种有结构的微生物聚集体，为其中的细菌提供了结构稳定性和保护性基质，使其能够抵御环境波动，特别是防止干燥和增强对渗透胁迫的耐受性。
然而，尽管生物被膜的重要性已被认识，但在干旱条件下其形成的动态过程、及其在增强植物抗旱性中的直接贡献和调控机制，目前仍知之甚少。另一方面，为应对干旱，植物会优化水分吸收和运输策略，而水通道蛋白（aquaporins， AQPs）是这一过程的核心，它们是促进水分和小分子中性溶质跨细胞膜运输的跨膜通道蛋白。近期研究证实，一些有益微生物可以调节宿主AQPs的表达，但一个明确的、由生物被膜介导的作用模式在此调控级联反应中的具体角色，仍是我们知识体系中的一个根本性空白。
基于此，本研究旨在深入探究贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株D103如何通过形成生物被膜来影响玉米的水通道蛋白，从而增强其抗旱性。研究目标具体包括：（1）探究干旱胁迫和根系分泌物对D103生物被膜形成及其转录调控的影响；（2）评估D103在干旱条件下的趋化介导的根际定殖能力及其对生物被膜的依赖性；（3）评估D103接种对玉米生长、关键水通道蛋白基因表达及根际微生物组组成的影响；（4）通过使用生物被膜抑制剂和宿主基因沉默技术，确定D103介导的抗旱性中生物被膜形成和宿主水通道蛋白的必要性和功能意义。本研究旨在为基于微生物的干旱缓解策略开发和促进农业可持续发展提供理论基础。
详细工作流程
本研究设计了一系列严谨的实验，结合生理学测量、生物被膜抑制、双转录组学和水通道蛋白基因靶向沉默等技术，系统性解析了上述问题。整个工作流程包含多个相互关联的环节。
首先，研究材料的准备与基础表征。使用的菌株为先前报道过的贝莱斯芽孢杆菌D103，保存于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC），编号CGMCC22905。实验前从-80°C甘油保藏管中复苏并培养至适宜浓度。玉米植株为B73品种。
第一部分：干旱与根系分泌物对D103生物学特性的影响。 研究模拟了干旱条件（使用PEG-6000制造0%至25%的渗透胁迫梯度）并收集了玉米根系分泌物，探究它们对D103生长、生物被膜形成、胞外聚合物（Exopolysaccharides， EPS）产生及趋化性的影响。具体实验包括：1）生长曲线测定：在不同PEG浓度、根系分泌物及生物被膜抑制剂EDTA的LB培养基中培养D103，监测其生长。2）生物被膜定量：采用结晶紫染色法，在MSGG培养基中静态培养D103，量化不同处理下（PEG梯度、添加根系分泌物或EDTA）的生物被膜形成量。每个处理设置6个独立生物学重复。3）EPS产量测定：在不同处理的LB培养基中静态培养D103后，通过乙醇沉淀法提取并称量干燥的EPS质量。每个处理3个重复。4）趋化性测定：采用改良的毛细管法，评估D103在不同PEG胁迫下对玉米根系分泌物以及多种常见糖类和有机酸（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、苹果酸、柠檬酸、富马酸）的趋化反应。每个处理3个重复。
第二部分：D103的转录组学分析。 为了解D103对根际环境的分子适应策略，对D103在四种条件下（对照、10% PEG干旱胁迫、1%根系分泌物、干旱+根系分泌物）进行了转录组测序。每个条件3个生物学重复。RNA提取后，去除核糖体RNA，构建链特异性cDNA文库，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行150 bp双端测序。使用fastp进行质控，使用RSEM将clean reads比对到D103参考基因组，利用DESeq2识别差异表达基因（DEGs），并进行GO和KEGG功能富集分析。
第三部分：D103在玉米根部的定殖评估。 研究评估了干旱胁迫和生物被膜抑制剂EDTA对D103在玉米根部定殖的影响。将表面灭菌的玉米幼苗在含有不同浓度PEG（0%-25%）的蛭石-液体MS培养基系统中生长10天后，接种D103菌悬液（含或不含EDTA）。接种36小时后，收集根部，匀浆后进行平板计数，计算每克鲜根重的菌落形成单位（CFU）。每个处理6个重复。同时，利用扫描电子显微镜（SEM）直接观察不同处理（正常/干旱，接种D103 ± EDTA）下玉米根表D103的附着和生物被膜形成情况。
第四部分：盆栽实验评估D103生物被膜对玉米抗旱性的作用。 通过盆栽实验，使用EDTA作为生物被膜抑制剂，系统评估了生物被膜破坏对D103诱导的抗旱性的影响。设置了16个处理组合，涉及两种土壤类型（有植物/无植物）、两种水分状况（正常浇水/干旱胁迫）和四种改良措施（对照、接种D103、添加EDTA、D103+EDTA）。对于植物相关的处理，每个处理至少培育9株植物，并从中随机选取9株作为独立的生物学重复进行后续测量。在幼苗三叶期开始进行为期14天的干旱处理。测定指标包括：株高、叶片相对含水量、地上部和根部鲜/干重、非根际和根际土壤含水量。同时，采用热水提取法从土壤中提取EPS，并通过苯酚-硫酸法测定其多糖含量。
第五部分：玉米根部转录组与根际微生物组分析。 为了探究D103影响玉米抗旱性的分子机制，对四种处理（正常浇水对照、正常浇水+D103、干旱胁迫对照、干旱胁迫+D103）的玉米根部进行了转录组测序。每个处理3个生物学重复，每个重复来自至少9株幼苗根组织的混合。RNA提取、文库构建和测序流程与细菌转录组类似，使用Hisat2将reads比对到玉米B73参考基因组v4。差异表达分析聚焦于水通道蛋白基因，并通过qRT-PCR对关键基因进行了验证。同时，收集上述四种处理的根际土壤，提取总DNA，扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区，在Illumina NovaSeq平台上进行测序。使用DADA2生成扩增子序列变体（ASVs），并利用SILVA数据库进行分类学注释。通过LEfSe分析寻找组间差异显著的类群，并使用Tax4Fun基于16S数据预测微生物群落的功能谱。
第六部分：病毒诱导的基因沉默（VIGS）功能验证。 为了明确关键水通道蛋白在D103介导的抗旱性中的作用，研究采用了基于黄瓜花叶病毒（CMV）的VIGS系统，分别沉默了玉米中的Zmpip2;6和Zmtip1;1基因。设计了约230 bp的特异性片段，克隆到pCMV201-2BN81载体，通过农杆菌介导的侵染方法获得重组病毒液，注射到玉米种子胚中。设置了12个处理组合，涉及基因沉默构建体（对照、GFP对照、Zmtip1;1沉默、Zmpip2;6沉默）、生物被膜抑制剂（± EDTA）和细菌接种（± D103）。每个处理培育至少9株植物，并从中随机选取9株作为生物学重复。在植株三叶期进行自然干旱胁迫处理14天。测定生理参数（株高、相对含水量、生物量），并通过qRT-PCR验证基因沉默效率。同时，对沉默植株的根部进行了12种营养元素（C， N， P， K， Cu， Ca， Mg， S， Fe， Mn， Zn， B）的含量分析。
第七部分：数据处理与统计分析。 所有实验数据均进行正态性和方差齐性检验。涉及两个独立因素的实验（如生物被膜、EPS、定殖实验）采用双因素方差分析（ANOVA）；两组间比较采用学生t检验；多组间比较采用单因素ANOVA。当ANOVA显示显著差异时，使用Tukey‘s HSD检验进行事后多重比较。效应量以偏η²（η²）报告。结果以平均值±标准差表示。
主要研究结果
1. 根系分泌物与干旱胁迫协同促进D103生物被膜形成。 D103本身具有耐旱性，即使在25% PEG下也能生长。双因素方差分析显示，PEG浓度和根系分泌物对生物被膜形成均有极显著影响，且存在显著交互作用。中度干旱胁迫（5%-15% PEG）显著刺激了生物被膜发育，增幅达66%至166%。根系分泌物的添加进一步增强了各PEG浓度下的生物被膜形成。EPS产量也呈现类似趋势，干旱胁迫和根系分泌物均能显著促进EPS产生。化学趋向性实验表明，中度干旱（10% PEG）增强了D103对玉米根系分泌物以及多种有机酸（苹果酸、柠檬酸）和糖类的趋向响应，这为后续的根际定殖提供了前提。
2. D103转录组揭示从运动到固着生活方式的战略转变。 转录组分析表明，D103对根系分泌物和干旱胁迫的响应涉及深刻的基因重编程。一个包含248个基因的核心集合在所有处理中表现出保守的表达模式，代表了对干旱根境的通用适应特征。值得注意的是，与生物被膜形成、群体感应、孢子形成以及抗菌聚酮/非核糖体肽合成相关的基因被显著上调。与此同时，与鞭毛组装和趋化性相关的基因在所有处理中均显著下调。这表明D103在感知根境信号后，战略性地将细胞资源从高能耗的游动和觅食重新分配到支持生物被膜为中心的生活方式，以增强根际定殖和胁迫耐受性。
3. 生物被膜是D103有效定殖玉米根部的关键。 根际定殖实验的双因素方差分析显示，干旱胁迫和EDTA对定殖均有极显著影响，且EDTA的影响占主导。中度干旱（10% PEG）下D103定殖水平最高。然而，添加EDTA后，定殖水平在所有胁迫梯度下均急剧下降（例如，在10% PEG下减少了77.6%）。扫描电镜结果直观地证实了这一结论：在干旱条件下接种D103，根部表面可观察到包裹着高密度细菌细胞的广泛生物被膜；而在添加EDTA的处理中，几乎看不到生物被膜结构。这些结果强有力地证明，生物被膜的形成是D103成功定殖玉米根部的基础。
4. D103通过生物被膜依赖的方式促进玉米生长并改善根境水分状况。 盆栽实验表明，D103接种在正常和干旱条件下均能显著促进玉米生长，提高株高、生物量和叶片相对含水量。然而，这些益处被同时添加的EDTA所抵消，而单独使用EDTA对植物生长无显著影响，表明生物被膜的形成对于D103介导的生长促进和抗旱性是必不可少的。此外，在干旱条件下，D103接种显著提高了非根际和根际土壤的含水量以及EPS含量。这些改善同样依赖于完整的生物被膜，因为添加EDTA后效果消失。这支持了生物被膜（通过EPS）有助于在根际建立并维持一个更湿润的微环境的观点。
5. D103上调玉米关键水通道蛋白基因，且依赖于生物被膜。 玉米根部转录组分析发现，在干旱条件下，D103接种特异性地富集了与水分运输相关的GO通路，如“水跨膜转运蛋白活性”和“水通道活性”。差异表达分析显示，在干旱胁迫下，共有7个AQP基因在D103接种后显著上调。qRT-PCR验证了这些结果，并发现其中Zmpip2;6和Zmtip1;1的表达水平最高。至关重要的是，当添加EDTA抑制生物被膜后，除Zmpip1;5和Zmpip1;6外的其他AQP基因（包括Zmpip2;6和Zmtip1;1）的表达均回落到与未接种D103时相似的水平。这表明D103生物被膜是上调这些关键水通道蛋白基因所必需的。
6. D103重塑根际微生物群落，富集有益抗旱类群。 根际微生物组分析显示，D103接种改变了群落结构。在门水平上，它增加了变形菌门、绿弯菌门和厚壁菌门的相对丰度。在属水平上，D103富集了多个有益类群，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、金黄线菌属和醋杆菌属等。在干旱胁迫下，D103接种进一步增强了这些属的相对丰度。功能预测表明，D103接种增强了硝酸盐还原和芳香族化合物降解等关键微生物功能。这些变化共同表明，D103不仅自身发挥作用，还能招募并构建一个协同增效的、适应干旱的微生物群落，为植物创造更有利的根际环境。
7. 基因沉默验证揭示水通道蛋白的功能层级与非冗余性。 VIGS功能验证是本研究的关键环节，它明确了特定AQP基因在D103介导的抗旱性中的具体作用。结果发现：a) 沉默Zmpip2;6或Zmtip1;1均使玉米对干旱更为敏感，表现为相对含水量和生物量下降，以及多种营养元素积累减少。b) 在Zmtip1;1沉默株系中，接种D103仍然可以部分恢复其抗旱性和养分含量，并且qRT-PCR显示其他TIP同源基因（如Zmtip1;2）被代偿性上调，这种代偿性上调依赖于生物被膜。这表明Zmtip1;1的功能在一定程度上可由其他家族成员补偿。c) 然而，在Zmpip2;6沉默株系中，接种D103（无论是否添加EDTA）完全无法改善其抗旱表型或养分状况。 这一结果证明，Zmpip2;6在D103生物被膜介导的抗旱性中扮演着不可替代（非冗余） 的核心枢纽角色。
研究结论与价值
本研究系统性地揭示并证实了贝莱斯芽孢杆菌D103的生物被膜形成是其增强玉米抗旱性的一个核心机制。研究者提出了一个协同作用框架模型：由干旱诱导的玉米根系分泌物启动，促进D103形成稳固的生物被膜；该生物被膜一方面通过EPS等改善根际微域的水分保持，另一方面作为跨王国交流的界面，系统性地调控宿主玉米的水通道蛋白表达，特别是非冗余性的Zmpip2;6；同时，生物被膜还介导了根际微生物群落的重构，富集了有益的抗旱类群。这些过程相互协同，最终整合性地提升了植物在干旱胁迫下的水分稳态。
本研究的科学价值在于：首先，它将PGPR介导的抗旱性研究从“微生物存在与否”的层面，推进到了“微生物群落结构（生物被膜）如何发挥作用”的机制层面，深化了对植物-微生物互作的理解。其次，研究通过精巧的VIGS实验，首次在PGPR-植物互作背景下揭示了水通道蛋白家族成员（PIP2 vs. TIP）在功能上的层级差异和非冗余性，为理解植物应对生物助迫的分子调控网络提供了新视角。最后，研究建立了从细菌感知信号（干旱、根系分泌物）、到生活方式转变（转录重编程）、再到物理定殖（生物被膜）、进而调控宿主生理（水通道蛋白）并影响根际生态（微生物组）的完整逻辑链条，具有重要的理论创新性。
在应用价值方面，本研究为开发高效、稳定的微生物菌剂提供了直接的机制基础。研究结果表明，筛选和改造具有强生物被膜形成能力的PGPR菌株，或将其与能够诱导关键水通道蛋白（如Zmpip2;6）表达的特定信号分子相结合，可能是未来设计新一代抗旱微生物接种剂的有效策略。同时，研究强调了在田间应用中维持或促进有益生物被膜形成的重要性。
研究亮点