本研究由朱燕、陈月华、张翔、谢国勇及秦民坚等人完成，主要作者来自中国药科大学中药学院中药资源学系（Department of Resources Science of Traditional Chinese Medicines, School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University），其中陈月华同时隶属于辽宁中医药大学药学院。该研究于2020年1月23日投稿，2020年6月1日被接收，并于2020年6月8日在线发表于《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》期刊，文章标题为“Copper stress-induced changes in biomass accumulation, antioxidant activity and flavonoid contents in Belamcanda chinensis calli”。

本研究属于植物生理学与植物组织培养交叉领域，重点关注重金属铜胁迫（copper stress, CS）对药用植物射干（Belamcanda chinensis）愈伤组织生长、抗氧化防御系统及次生代谢产物黄酮类化合物积累的影响。铜是植物生长必需的微量元素，作为多种蛋白质的辅因子参与诸多生理过程，但过量铜会通过催化活性氧（reactive oxygen species, ROS）的过量产生，引发次级氧化胁迫，损伤核酸、膜脂及功能蛋白，最终抑制植物生长。射干是中国、日本及俄罗斯东部广泛分布的多年生草本植物，其干燥根茎为中药“射干”，具有数千年的药用历史，主要用于治疗咽喉肿痛、哮喘及肺部疾病。射干中的主要生物活性成分为异黄酮类化合物，如鸢尾苷（tectoridin）、鸢尾苷元（tectorigenin）、野鸢尾苷（iridin）、野鸢尾苷元（irigenin）及鸢尾花素（irisflorentin）等。然而，尽管射干具有优良的抗逆性，关于重金属尤其是铜对其生理及次生代谢影响的研究仍非常有限。因此，本研究旨在系统探究不同浓度铜胁迫下射干愈伤组织的生物量积累、抗氧化酶活性、脯氨酸含量、膜脂过氧化水平以及黄酮类化合物含量的动态变化，从而揭示植物细胞响应铜胁迫的自我防护机制及其协同方式。

在研究方法与工作流程方面，本研究以两年生射干幼苗的幼芽（0.5–0.8 cm）为外植体，经75%乙醇表面消毒30秒、0.1%氯化汞消毒10分钟，再以无菌蒸馏水冲洗5次后，接种于添加30 g L⁻¹蔗糖、5.5 g L⁻¹琼脂、1.0 mg L⁻¹ 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、1.0 mg L⁻¹ 6-苄氨基嘌呤（6-BA）、0.5 mg L⁻¹萘乙酸（NAA）及10 mg L⁻¹硝酸银的Murashige and Skoog (MS)培养基中。培养条件为25 ± 1 °C、暗培养，5周后出现黄色愈伤组织。为获得均质愈伤组织，在含1.0 mg L⁻¹ 2,4-D、1.0 mg L⁻¹ 6-BA和1.0 mg L⁻¹ NAA的相同MS培养基中进行多次继代培养，最终以均质愈伤组织作为实验材料。铜处理实验共设四个浓度组：0 mg L⁻¹（对照组）、50 mg L⁻¹、100 mg L⁻¹和200 mg L⁻¹ CuCl₂，在继代培养基中分别添加相应浓度CuCl₂。每个处理设三个重复，每皿接种1.7 g愈伤组织，连续观察49天，每隔7天测定各项生理生化指标。生物量积累测定方面，称量对照组及铜处理组愈伤组织的鲜重（fresh weight, FW），并按照公式“愈伤组织生长抑制率(% of control) = [(A − B)/A] × 100%”计算生长抑制率，其中A为对照组平均愈伤组织重量，B为处理组重量。抗氧化酶活性测定包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和愈创木酚过氧化物酶（guaiacol peroxidase, GPX）。SOD活性采用Vaidyanathan等（2003）方法稍作改进进行测定，以氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium, NBT）还原抑制率定义酶活性单位，在560 nm处测定吸光度；GPX活性采用Kalir等（1984）方法改进，通过监测470 nm处愈创木酚氧化导致的吸光度增加来计算酶活性。脯氨酸含量以Bates等（1973）方法为基础，使用3%磺基水杨酸提取，经酸性茚三酮显色后于520 nm处测定吸光度，以L-脯氨酸为标准品建立标准曲线（y = 0.0525x − 0.0171, r² = 0.9995），结果以μg g⁻¹鲜重表示。膜脂过氧化水平通过测定丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量进行评估，采用Lokhande等（2011）方法，样品经10%三氯乙酸研磨提取，与0.6%硫代巴比妥酸反应后于532、600及450 nm处测定吸光度，利用摩尔消光系数（ε = 1.55 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹）计算MDA浓度。黄酮类化合物含量采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）对12种黄酮类化合物进行定量分析，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm, 5 µm），流动相由含0.4%乙酸的水溶液（A相）和乙腈（B相）组成，洗脱梯度为0 min 8% B、15 min 17% B、35 min 19% B、40 min 21% B、43 min 26% B、65 min 40% B、75 min 50% B，流速1.0 mL min⁻¹，检测波长269 nm，进样量20 µL。12种黄酮标准品包括新芒果苷（neomangiferin）、芒果苷（mangiferin）、鸢尾苷、鸢尾甲苷B（iristectorin B）、鸢尾甲苷A（iristectorin A）、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲苷元A（iristectorigenin A）、野鸢尾苷元、鸢尾花素、鸢尾酮（irilone）及二氯鸢尾素（dichotomitin），均从射干或鸢尾（Iris tectorum）干燥根茎中分离纯化获得。数据分析采用完全随机设计，结果以均值±标准差表示，并通过归一化方法将各指标变化趋势在0–100%范围内进行比较，以分析不同参数之间的动态关系。此外，还进行了多因素相关性分析，以探索各生理生化指标间的统计学关联。

研究结果显示，铜胁迫对射干愈伤组织的生物量积累具有明显的浓度和时间依赖性抑制作用。对照组愈伤组织呈现典型的S型生长曲线，最大生物量出现在第42天；50 mg L⁻¹ CuCl₂处理组生长节奏与对照组基本同步，但较高浓度（100和200 mg L⁻¹）显著降低生物量积累，且生长抑制率随胁迫时间延长而增加。50 mg L⁻¹处理组抑制率在21天前持续增强，之后减弱，提示较低浓度铜胁迫下愈伤组织可激活保护性代偿机制修复损伤。游离脯氨酸含量在对照组随培养时间延长而下降，50和100 mg L⁻¹处理组亦呈下降趋势，但200 mg L⁻¹处理组脯氨酸含量在第7至21天上升，第21天达到峰值后下降，表明高浓度铜胁迫能在早期迅速激活脯氨酸介导的自我保护机制，而该机制主要在胁迫早期发挥作用。SOD活性变化分为上升期和下降期，0–28天为上升期，第28天达峰值，之后下降但仍高于对照；且在第21、28、35、42和49天，SOD活性随铜浓度增加而升高，表现出浓度依赖性。GPX活性变化同样分为上升和下降两个阶段，在50和100 mg L⁻¹处理组中第35天达峰值，较SOD峰值时间滞后，原因在于GPX的底物过氧化氢（H₂O₂）由SOD催化超氧阴离子产生，属于下游酶；然而200 mg L⁻¹处理组GPX活性在整个实验期间持续下降，说明高浓度铜可能直接损伤GPX蛋白结构。MDA含量在实验前21天与对照无显著差异，第21天后急剧上升，且与铜浓度无显著相关性，表明膜脂过氧化是氧化损伤过程的后期事件，对铜浓度不敏感。黄酮类化合物方面，对照组未检测到黄酮，说明正常培养的射干愈伤组织不产生或仅产生极少量黄酮。在50和100 mg L⁻¹处理组中，第21天总黄酮（total flavonoids, TFs）产量及黄酮种类数达到最大值，分别为0.48 mg g⁻¹干重（dry weight, DW）和0.75 mg g⁻¹ DW，均产生3种黄酮；而200 mg L⁻¹处理组总黄酮产量在第42天达到5.46 mg g⁻¹ DW，种类数达11种，其中主要成分为鸢尾甲苷元A、鸢尾苷元及鸢尾苷。总黄酮产量和种类数量均随铜浓度升高而增加，表明铜离子可刺激黄酮生物合成途径。多因素相关性分析显示，SOD与脯氨酸活性在不同CuCl₂浓度下呈强正相关；50 mg L⁻¹时SOD活性与生物量积累呈负相关，而200 mg L⁻¹时GPX活性与生物量积累呈负相关；MDA与脯氨酸在200 mg L⁻¹时呈显著负相关，GPX活性与总黄酮亦呈负相关。这些结果说明当GPX酶受损时，黄酮类防御机制被触发，生成更多黄酮化合物以补偿GPX功能缺失。

综合来看，本研究揭示了射干愈伤组织在铜胁迫下通过多种抗氧化防御机制的有序激活与互补协同来抵抗铜毒害。在50和100 mg L⁻¹铜处理下，抗氧化机制达到峰值的顺序依次为脯氨酸、总黄酮、SOD、GPX，各机制作用时间错开，形成时间依赖性的互补保护体系；而在200 mg L⁻¹铜胁迫下，GPX首先受到攻击，激活顺序改变为GPX、脯氨酸、SOD、总黄酮。该研究不仅系统阐明了射干响应铜胁迫的生理生化基础，还为利用铜离子作为诱导子促进药用植物愈伤组织体外生产高附加值黄酮类化合物提供了可行的生物合成策略。尤其是200 mg L⁻¹铜处理下，射干愈伤组织可产生11种黄酮类化合物且达到毫克级产量，显示出重要的药物开发应用潜力。此外，该研究也为了解植物重金属耐受机制、酶促与非酶促防御系统的协同调控提供了重要实验依据。