Academic Report

研究作者及发表信息

本文的主要作者为Chen Aimei、Shi Qingshan、Ouyang Yousheng及Chen Yiben，研究机构为Guangdong Institute of Microbiology、Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology、Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application以及State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry–Guangdong Province Jointly Breeding Base)。研究成果发表于《Journal of Rare Earths》第30卷第9期（2012年9月），DOI为10.1016/s1002-0721(12)60159-8。

研究背景

本研究属于稀土元素及其生物学效应领域。稀土元素以其独特的电子壳层及核结构在抗菌、抗炎、抗肿瘤等方面展现出良好的潜力，同时稀土化学的低毒性特性让其在农业、医疗保健及其他相关领域显现出良好的应用前景。近年来，关于稀土元素与其配合物抗菌机制的探讨逐渐成为研究热点。在细菌细胞的超微结构变化中，尤其是细胞表面结构受到越来越多的关注。例如实验表明：某些稀土离子（如La³⁺和Pr³⁺）改变大肠杆菌（Escherichia coli）外膜结构，并可通过竞争与位点结合取代Ca²⁺和Mg²⁺离子，从而引发一系列生物效应。本研究聚焦于稀土离子Ce³⁺对大肠杆菌细胞膜渗透性的影响，探讨其抗菌机制。

研究流程与方法

研究工作围绕以下几个核心实验程序展开：

1. 菌株与实验材料的准备

研究所用菌株为大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 8739），购自广东省微生物菌种保藏中心。培养基为LB培养基，其中含有0.5 g NaCl、1 g 蛋白胨及0.5 g 酵母提取物，每100 mL溶液的pH值为7.0。实验用的Ce(NO₃)₃·6H₂O购自上海国药集团，并配制成100 mmol/L的储备液。此外，实验所用的探针如N-phenyl-1-naphthylamine（NPN）和o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）分别购自Sigma和Aladdin公司。

2. 抗菌活性实验

研究通过采用大肠杆菌存活率测定方法验证Ce³⁺的抗菌活性。具体步骤包括：将培养至对数生长期的大肠杆菌菌液调整至1×10⁸ CFU/mL，加入不同浓度的Ce³⁺溶液（0、0.25、2.5 mmol/L），经过2 h和24 h的不同处理时间后，通过LB琼脂平板计数测定菌落存活数，并计算存活率。

3. 透射电子显微镜（TEM）观察细胞结构

对不同浓度的Ce³⁺作用时间（0.5 h、2 h、24 h）的大肠杆菌，制备超薄切片，通过透射电子显微镜观察细胞结构及表面形态的变化。

4. 外膜（OM）渗透性测定

采用NPN荧光探针测定外膜的渗透性。NPN作为疏水性荧光探针在进入细胞膜的疏水环境中会显著增强荧光，实验通过加入不同浓度的Ce³⁺后监测随时间变化的荧光强度，分析外膜被破坏的程度。

5. 内膜（IM）渗透性测定

利用ONPG方法测定内膜的渗透性。ONPG作为人工底物，在被细胞释放的β-半乳糖苷酶分解后生成黄色产物o-nitrophenol（ONP），通过比色分析415 nm处吸光度（A₄₁₅）的变化揭示内膜损伤情况。

研究结果

1. 抗菌活性

实验结果显示，Ce³⁺对处于对数生长期的大肠杆菌有较强的抗菌活性，存活率随着Ce³⁺浓度升高逐渐下降。在实验中，0.25 mmol/L和2.5 mmol/L浓度的Ce³⁺分别在2 h内将存活率降低至0.09%和0%，并在24 h后彻底杀灭了细菌。

2. 细胞结构的变化（TEM分析）

透射电子显微镜图像显示，大肠杆菌细胞在高浓度Ce³⁺（2.5 mmol/L）作用下，细胞壁完全被破坏，仅留下了胞质膜。此外，随着处理时间的增加，低浓度Ce³⁺（0.25 mmol/L）下也观察到细胞表面出现小颗粒，推测为细胞壁的碎片。相比之下，对照组细胞结构完整，只有轻微的粗糙化。

3. 外膜渗透性

NPN荧光实验结果表明，加入Ce³⁺后荧光强度随时间逐渐增强，且显示浓度依赖性（2.5 mmol/L组荧光强度明显高于0.25 mmol/L组）。这表明Ce³⁺能够有效破坏细胞外膜，提高其渗透性。

4. 内膜渗透性

ONPG试验中，相比0 mmol/L对照组，0.25 mmol/L和2.5 mmol/L浓度下内膜渗透性显著增强。然而，在处理20 h后发现，Ce³⁺会抑制细胞释放的β-半乳糖苷酶与ONPG反应，从而造成吸光度未完全呈现正相关的现象。这一结果表明，虽然ONPG实验受到了某些干扰，但总体证明了Ce³⁺对细胞内膜渗透性的破坏作用。

结论

本研究系统探讨了稀土离子Ce³⁺对大肠杆菌细胞膜渗透性的影响，确认其抗菌活性机制主要通过以下几点实现： 1. Ce³⁺破坏了细胞外膜的完整性，显著提高了外膜的渗透性； 2. Ce³⁺破坏了内膜结构，进而影响细胞的正常生理代谢活动； 3. Ce³⁺可能通过与细胞内部蛋白质的相互作用进一步阻碍细菌的生理功能。

本研究不仅深化了对稀土离子抗菌机制的认知，也为稀土在农业、医疗等领域中的应用提供了理论支持。

研究亮点与意义

1. 研究亮点：首次系统研究了Ce³⁺对大肠杆菌外膜和内膜渗透性的影响，结果表明Ce³⁺在时间和剂量上具有强效和多维度的抗菌作用。
2. 科学与应用价值：本研究为稀土应用提供了更多实验依据，推动了稀土材料在抗菌药物研发及医学领域拓展的潜力。
3. 独特性：创新性地结合NPN与ONPG实验验证细胞膜渗透性变化，揭示了稀土离子结合微生物细胞膜的分子机制。