本研究由 Luqin Wang、Lizhan Xiao、Gaoyang Zou、Huiping Mao 等作者（#表示共同第一作者）完成，通讯作者为 Baojian Liao、Zhen Zhang 和 Jing Liu。主要研究机构包括中国科学院广州生物医药与健康研究院、广州医科大学联合生命科学学院等。该研究于 2026 年发表在 Nature Communications 期刊上，标题为“Delicate inhibition of NFκB/RELA circuitry facilitates efficient transition towards ground-state pluripotency in human”。

研究背景

人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）在体外通常处于始发态（primed state），对应胚胎植入后的上胚层阶段；而原始态（naïve state）多能干细胞则对应着床前囊胚的内细胞团（inner cell mass, ICM），在再生医学和早期胚胎发育研究中具有更高价值。将始发态多能干细胞通过原始态转化（primed-to-naïve transition, PNT）重编程为原始态多能干细胞，是获得着床前上胚层样细胞的重要途径。然而，已有方法普遍存在转化效率不高、依赖饲养层细胞或异源成分、细胞异质性大等问题。更重要的是，目前对 PNT 过程中的关键转录因子及表观遗传调控机制仍不十分清楚。以往研究多集中于核心多能性基因如 OCT4、SOX2、NANOG 以及 KLF 家族等，对其他转录因子和微小 RNA（microRNA, miRNA）在 PNT 中的精细调控作用研究较少。因此，本研究旨在建立一种高效、无饲养层的 PNT 诱导体系，并系统解析 PNT 过程中的染色质可及性动态变化及 miRNA 调控网络，尤其关注炎症相关转录因子 NFκB/RELA 在该过程中的作用。

研究流程

研究首先通过高通量化合物筛选优化 PNT 诱导条件。以 H9 人胚胎干细胞为研究对象，采用两阶段诱导方案：第一阶段（第 0–3 天）使用 N2B27 培养基添加 PD0325901（MEK 抑制剂）、LIF 和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）VPA；第二阶段（第 3–12 天）在 N2B27 中添加 PD0325901、LIF、GO6983（PKC 抑制剂）、SB590885（FGFR 抑制剂）、Dasatinib（SRC 抑制剂）、XAV939（WNT 抑制剂）、BIRB796（p38 抑制剂）和维生素 C。通过流式细胞术检测 SUSP2（一种原始态细胞表面标志物）阳性细胞比例来评估 PNT 效率。通过逐一去除各成分的 drop-out 实验验证各组分必要性。随后对获得的原始态细胞进行多能性标志物免疫荧光、X 染色体再激活检测（TN5-FISH 检测 HUWE1 新生转录本）、畸胎瘤形成实验、滋养层和原始内胚层分化实验及类囊胚（blastoid）形成实验。为研究细胞群体异质性，对第 0、3、6、9、12 天的细胞进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），获得 79666 个细胞的转录组数据。为解析染色质可及性动态，对相同五个时间点进行了 ATAC-seq，并利用 HOMER 软件进行 motif 富集分析。为研究 miRNA 的时序变化，对五个时间点进行了 miRNA-seq。随后，利用慢病毒载体在 H9 细胞中分别稳定过表达或敲低 RELA、NFKBIA，以及过表达 miR-372/373，并通过流式、qRT-PCR 和 RNA-seq 评估其对 PNT 的影响。为探究 RELA 的全基因组结合图谱，在 H9 细胞中表达 FLAG 标记的 RELA 并进行了 CUT&Tag 测序。最后，通过双荧光素酶报告实验验证 miR-³⁷²⁄₃₇₃ 对 RELA 3′UTR 的直接靶向作用。

主要结果

在诱导体系优化方面，高通量筛选发现第二阶段添加 FGFR 抑制剂 SB590885、SRC 抑制剂 Dasatinib 和 PKC 抑制剂 GO6983 能显著提高 SUSP2 阳性细胞比例和克隆形成数。最终优化的两阶段方案在第 12 天可获得约 90% 的 SUSP2 阳性细胞。drop-out 实验表明 SRCi、PKCi 和 FGFi 对克隆形成和原始态基因 KLF17、DPPA3 的表达具有重要作用。RNA-seq 的主成分分析（PCA）显示该两阶段方案获得的细胞转录组更接近已报道的原始态细胞。诱导获得的原始态细胞表达 KLF17 和 TFCP2L1，X 染色体在雌性细胞中重新激活，并能在体内形成包含三个胚层的畸胎瘤。在体外，这些细胞可分化为滋养层样细胞和原始内胚层样细胞，并能形成表达 OCT4、GATA3 和 SOX17 的类囊胚结构。单细胞 RNA-seq 显示第 12 天细胞分为两个亚群：一个为真正的原始态细胞群，高表达 NANOG 等多能性基因；另一个为滋养层样细胞群，高表达 GATA3、TP63 和 KRT7，这与已有报道一致。

ATAC-seq 分析揭示了 PNT 过程中染色质可及性的动态变化。闭合位点的 motif 富集分析显示 ZIC 家族、ZFP281、RFX 家族和 NFκB-p65 的结合基序显著富集；而开放位点则主要富集 KLF 家族结合基序。其中 ZIC、ZFP281 和 KLF 在 PNT 中的作用已有报道，但 RFX 和 NFκB 尚未被研究。RNA-seq 显示 ZIC 和 RFX 家族转录因子表达下调，NFKBIA（NFκB 核转位抑制剂）表达上调，KLF 家族表达上调。

功能实验表明，过表达 NFKBIA 或敲低 RELA 可提高 SUSP2 阳性细胞比例和克隆数，并上调 DPPA3、DNMT3L、TBX3、NANOG 等原始态标志物；过表达 RELA 或敲低 NFKBIA 则产生相反效果。在亚优化的单阶段诱导方案（仅使用第二阶段培养基）中，这种效应更为显著。在其他 PNT 体系（无饲养层 PXGL 和 HENSM 方案）中也验证了 NFκB 通路的抑制作用。小分子抑制剂 LY2409881（IKK2 抑制剂）可降低磷酸化 RELA 水平，提高 PNT 效率。scRNA-seq 显示 LY2409881 处理增加了第 7 天原始态样细胞群的比例。

CUT&Tag 分析在始发态 H9 细胞中鉴定出 6479 个 RELA 结合峰，其中 20% 位于启动子区，30% 位于基因间区，40% 位于内含子区。整合 RNA-seq 和 CUT&Tag 数据发现，580 个基因的启动子区被 RELA 结合且表达在 PNT 中显著变化，其中 429 个基因下调。进一步分析发现 CXCL1、IKBKE、VEGFR1 和 HMGB2 等基因在 PNT 中表达下调和染色质关闭，且启动子区有 RELA 结合。过表达 IKBKE 或 VEGFR1 可降低 SUSP2 阳性细胞比例和原始态标志物表达，表明它们是 RELA 下游的 PNT 屏障基因。

miRNA-seq 显示 miR-³⁷²⁄₃₇₃ 簇在 PNT 中显著上调，而 miR-302 簇和 miR-³⁶³⁄₁₀₆ 簇下调。ATAC-seq 显示 miR-³⁷²⁄₃₇₃ 基因组位点的染色质可及性在 PNT 中逐渐开放。过表达 miR-³⁷²⁄₃₇₃ 可提高 PNT 效率。RNA-seq 和生物信息学预测联合分析发现 RELA 是 miR-³⁷²⁄₃₇₃ 的直接靶基因之一，双荧光素酶报告实验证实 miR-³⁷²⁄₃₇₃ 可抑制 RELA 3′UTR 报告基因活性，Western blot 显示 miR-³⁷²⁄₃₇₃ 过表达降低 RELA 蛋白水平。

结论与意义

本研究建立了一种高效、无饲养层、化学成分明确的两阶段 PNT 诱导体系，可在 12 天内将始发态人多能干细胞转化为原始态多能干细胞，获得约 90% 的 SUSP2 阳性细胞。该体系为研究人类着床前上胚层发育和再生医学应用提供了可靠平台。机制上，研究揭示了 NFκB/RELA 作为 PNT 的负调控屏障的作用：RELA 通过激活 IKBKE 和 VEGFR1 等着床期屏障基因抑制原始态建立；同时，miR-³⁷²⁄₃₇₃ 通过直接靶向 RELA 抑制 NFκB 信号，促进 PNT。这些发现阐明了 NFκB/RELA 轴在人类原始态多能性建立中的关键作用，为理解早期胚胎发育中的细胞命运决定提供了新视角，也为优化原始态多能干细胞培养和应用提供了潜在干预靶点。

研究亮点

本研究的亮点包括：1）建立了一种无饲养层、化学成分明确的高效 PNT 诱导方案，克服了以往方法效率低和依赖异源成分的局限；2）首次系统揭示了 NFκB/RELA 在人类 PNT 中的负调控作用及其下游效应分子 IKBKE 和 VEGFR1；3）发现了 miR-³⁷²⁄₃₇₃ 通过靶向 RELA 形成 miRNA-转录因子反馈调控环路，精细调节原始态多能性重建；4）整合了 scRNA-seq、ATAC-seq、miRNA-seq 和 CUT&Tag 等多组学数据，从染色质可及性、转录组和转录后调控多个层面系统解析了 PNT 的动态调控网络。研究还发现 LY2409881 等 NFκB 抑制剂可进一步提高 PNT 效率，具有潜在的转化应用价值。