大豆13-脂氧合酶GmLox6参与JA生物合成并正向调控盐胁迫耐受性的机制研究

作者及机构
本研究由东北农业大学农学院、智能农场技术与系统国家重点实验室、中国教育部大豆生物学重点实验室的Shuangzhe Li、Binshuo Zhang（共同第一作者）、Ping Ma、Yeqi Zhang、Zhenbang Hu、Xiaoxia Wu、Qingshan Chen及通讯作者Ying Zhao*团队完成，成果发表于*The Plant Journal*（2025年10月13日接受，DOI: 10.1111/tpj.70550）。

学术背景
研究领域：植物逆境生物学与激素信号调控。
研究动机：土壤盐渍化威胁全球7%的陆地面积和1/3灌溉农田，大豆（*Glycine max*）作为重要经济作物对盐胁迫高度敏感，导致产量显著下降。尽管茉莉酸（Jasmonic Acid, JA）被证实参与植物盐胁迫响应，但负责JA合成起始的脂氧合酶（Lipoxygenase, LOX）基因家族的功能机制尚不明确。
科学问题：大豆LOX基因（特别是GmLox6）如何通过JA途径调控盐胁迫耐受性？
研究目标：解析GmLox6在JA生物合成中的作用及其通过抗氧化防御和离子稳态增强大豆耐盐性的分子机制。

研究流程与方法
1. LOX基因家族全基因组分析
- 对象：大豆基因组中39个LOX基因（命名为GmLox1-GmLox39）。
- 方法：通过BLASTP比对、系统发育树构建（MEGA5.0）、启动子顺式元件分析（PlantCARE数据库）及组织表达谱分析（Phytozome数据）。
- 创新点：首次系统分类大豆LOX家族，发现GmLox6与拟南芥AtLox6同源性最高（66.3%），且在根中高表达并受盐和JA诱导。

1. GmLox6功能验证

   • 亚细胞定位：构建35S::GmLox6-GFP载体，通过拟南芥叶肉原生质体瞬时表达证实其定位于叶绿体。
     
   • 酶学特性：原核表达His标签重组蛋白，动力学分析显示GmLox6偏好α-亚麻酸（α-LeA，Km=19.32 nmol/L），为13-LOX型酶。
     

2. 转基因材料构建与表型分析

   • 材料：大豆品种DN50的过表达株系（GmLox6-OE）和CRISPR/Cas9敲除株系（GmLox6-CR）。
     
   • 处理：120 mM NaCl胁迫7天，测定生长参数（根长、生物量）、光合指标（Fv/Fm、叶绿素指数）及存活率。
     
   • 结果：OE株系盐胁迫下存活率87.1%，显著高于野生型（WT），CR株系仅37.8%；OE株系维持更高K+/Na+比（5.28 vs WT 3.45）。
     

3. 转录组与JA通路分析

   • RNA-seq：盐胁迫24小时后根组织测序（347,828,624 reads），鉴定3,417个上调基因（如PLA2、AOS、ACX等JA合成相关基因）。
     
   • JA含量测定：LC-MS/MS显示OE株系JA积累量较WT提高2.1倍，CR株系降低40%。
     

4. 抗氧化与离子稳态机制

   • ROS检测：DAB/NBT染色显示OE株系H₂O₂和O₂⁻积累减少，SOD、CAT活性提高30%-50%。
     
   • 离子分析：Corona Green荧光染色证实OE株系根尖Na⁺滞留减少，同时ASA（抗坏血酸）和GSH（谷胱甘肽）含量上升。
     

5. 转录调控机制解析

   • 分子对接与实验验证：预测并证实GmRWP-RK11（RWP-RK家族TF）结合GmLox6启动子（EMSA和Y1H验证）。
     
   • 功能验证：CRISPR敲除GmRWP-RK11的毛状根株系表现出GmLox6表达上调及耐盐性增强。
     

主要结果与逻辑关联
1. GmLox6的酶学特性：其叶绿体定位和13-LOX活性为JA合成提供空间和生化基础。
2. 表型与生理数据：OE株系通过增强JA合成（图4c）激活抗氧化系统（图5d），减少膜脂过氧化（MDA降低35%），维持离子平衡（图5e）。
3. 转录调控网络：GmRWP-RK11作为抑制因子被盐胁迫诱导，负调控GmLox6表达，形成反馈环路（图6f-g）。

结论与价值
1. 科学价值：首次阐明GmLox6-GmRWP-RK11模块通过JA途径协调ROS清除和Na⁺外排的分子机制，填补大豆LOX基因功能研究的空白。
2. 应用潜力：GmLox6可作为分子标记用于耐盐大豆育种，其过表达株系在盐渍土壤中增产潜力显著。

研究亮点
1. 创新发现：
- 揭示GmLox6通过JA合成“双途径”调控耐盐性（直接催化α-LeA氧化；间接激活抗氧化基因）。
- 鉴定GmRWP-RK11为JA通路的新负调控因子。
2. 方法学创新：
- 结合分子对接（AlphaFold 3）与EMSA精确解析TF-DNA互作。
- 开发大豆毛状根CRISPR体系快速验证基因功能。

其他价值
研究提出的“JA-ROS-离子稳态”调控模型（图7）为作物抗逆遗传改良提供新靶点，相关策略可扩展至其他豆科作物。