学术研究报告

一、研究概况

本文的主要作者包括Hui-Ni Tan、Wei-Qi Liu、Josh Ho等人，他们隶属于National Taiwan University、Academia Sinica以及其他机构。这项研究发表在 ACS Chemical Biology 期刊，文章发布日期为2024年8月20日，卷期为2024年第19卷（页码1982-1990）。研究聚焦于微囊素J25（Microcin J25，以下称为MccJ25）这一独特的套索型肽类抗生素的生物合成机制，展示了一种结合AlphaFold2（三维结构预测模型）与蛋白质工程研究的综合策略，通过结构预测和实验验证，探讨MccJ25前体识别中的分子与结构机制。

二、研究背景

微囊素J25是一种螺旋套索（lasso peptide）结构的抗生素，由21个氨基酸组成，具有抗菌活性。该肽分子因其特有的套索状结构和阻断细菌RNA聚合酶的能力，自1992年发现以来引起广泛关注。
MccJ25的生物合成是由微体素类肽生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster, BGC）编码的几种蛋白质协同完成的，其中包括前体蛋白（McjA）、用于前体识别与激活的蛋白酶（McjB）以及催化尾部环化形成套索结构的酶（McjC）。尽管生物合成过程的单步反应已有部分研究，但对这些多分子协同作用的结构和分子机制理解仍存空白。进一步研究这些蛋白的交互以及结构机制，对于理解套索肽类抗生素合成及其工程化有重要意义。

研究的主要目标是利用AlphaFold2预测McjA与McjB/McjC复杂的三聚体结构，并通过蛋白质工程手段验证其重要结构特征。这种结合计算预测与实验研究的流程为微囊素J25生物合成的研究打开了新的视角。

三、研究流程与方法

1. 结构预测

研究团队首先采用AlphaFold2将MccJ25的前体蛋白McjA及其两种生物合成酶McjB、McjC输入模型，将每种蛋白质分别作为单独的多肽序列进行预测，并检查其形成三聚体复合物的可能性。

预测结果表明，McjB在N端具有一个翼状螺旋结构域（RRE，负责前体识别），而其C端是一段典型的半胱氨酸蛋白酶结构域。McjC则包含一个腔体，用来给前体的核心肽段提供空间，支持Glu8与ATP结合，进一步形成环状结构。McjA则以无序状态结合于RRE，并由此引导整个合成的初始步骤。

2. 蛋白质工程验证

基于AlphaFold2提出的三维模型，作者设计了一系列蛋白突变和工程来验证模型的预测特征： - 结构域调换与环化突变：通过在McjB的不同位置（如60/61或80/81）进行循环置换（circular permutation, CP），验证其对活性影响。 - 断裂表达（Split）：将McjB分为负责识别的B1段和负责酶催化的B2段，测试分裂后的互补增强效果。 - 关键残基识别：如针对McjC的位点K337E和S440Y突变，考察其对领导肽段（leader peptide）的Glu8位点识别能力的影响。 - 合成补偿：在McjA关键位点（Thr(-2)位置）进行替换突变，并为其设计McjB的补偿性突变（如M108T），验证这种分子补偿机制能否恢复生物活性。

3. 数据分析

通过质谱（MALDI-TOF MS）和高效液相色谱（HPLC）结合抗生素抑菌实验，明确每种工程构建体在MccJ25产量方面的效果。对于量化结果，比较不同结构改造的产率并形成标准化评价。

四、研究结果

1. 三聚体结构确认： AlphaFold2预测到的McjA/McjB/McjC复合物中的关键交互面与天然生物合成步骤吻合：

   • McjB的两个功能结构域（RRE的B1和蛋白酶的B2）均显示出独立、但协同的作用。
   • McjC腔体中的盐桥（如K337与Glu8）对核心肽段的定位和稳定起重要作用。

2. 蛋白突变工程影响：

   • 循环置换（CP）： McjB的80/81位点循环置换（MCJBCP80/81）表示显著恢复MccJ25产物约为野生型的4.4%，较其他CP构建体更优。
   • 断裂表达： 通过80/81位点将McjB分裂成两个功能片段（MCJBS80/81），仍显示较强的生物活性（约为野生型的41%）。

3. 残基突变验证：

   • McjC的突变K337E和S440Y确认其分别对酯化和空间稳定产生显著影响，产量跌至野生型的2.4%-8.1%。

4. 合成补偿设计：

   • 针对McjA变体Thr(-2)->Met的问题，通过引入McjBM108T突变，实现产量从接近零恢复到5.4%，有效支持了计算模型对关键结合口袋与分子补偿机制的预测。

五、研究结论

通过结合AlphaFold2的结构预测与蛋白质工程实验，本文研究验证了MccJ25合成过程的分子机制及其关键互动元素。这些亮点包括： - 提供了McjA与McjB/McjC合作形成的三聚体复合物的合理模型； - 首次实现了环化突变（CP）和断裂表达在套索肽生物合成研究中的应用； - 明确了特定关键残基在分子识别和合成反应中的核心作用。

研究结果揭示了一种新颖的计算与实验联合研究模式，可广泛应用于其他复杂天然产物的生物合成与工程改造中。

六、研究亮点与意义

1. 科学价值：
   研究填补了对套索肽类抗生素分子机制的多个空白，为探索类似天然产物的生物合成开辟了道路。

2. 应用价值：
   结合AlphaFold2的结构预测方法与实验验证流程，可在未来指导新型抗生素开发，或者设计改造具有更高效能的合成酶。

3. 新颖方法：
   首次引入循环置换（CP）与分裂策略作为研究天然产物酶活性的工具，并验证了其潜在的工程化应用。

这项研究展示了通过整合计算生物学与实验的创新路径，为深度解析和开发复杂天然产物的分子机制提供了有力的例证。