这篇文档属于类型a，是一篇关于RNA-蛋白质相互作用研究的原创学术论文。以下为详细报告：

作者及机构
本研究由Laura Roszyk（第一作者）、Sebastian Kollenda和Sven Hennig（通讯作者）合作完成，作者单位包括德国马克斯-普朗克学会化学基因组学中心、杜伊斯堡-埃森大学无机化学研究所，以及荷兰阿姆斯特丹自由大学有机化学系。研究成果发表于《ACS Chemical Biology》期刊，2017年10月23日在线发表，卷12期，页码2958–2964。

学术背景
RNA在基因调控、核组织和代谢等细胞过程中发挥关键作用，但其生化分析面临挑战。传统研究RNA相互作用的方法（如荧光共振能量转移FRET）需对RNA和蛋白质同时进行荧光标记，操作复杂且可能干扰天然结构。本研究旨在开发一种基于RNA适配体“Spinach”的新型FRET系统。Spinach是一种基因编码的RNA适配体，能结合小分子染料DFHBI并激活荧光，无需化学标记即可实现RNA荧光标记。此前Spinach尚未被用于FRET体系，本研究首次证明其可通过近距离相互作用被淬灭，从而定量分析RNA-蛋白质相互作用。

研究流程与实验设计
1. RNA-DNA相互作用的淬灭验证
- 研究对象：改造后的Spinachδ15 RNA（截短15个核苷酸以暴露单链区）与互补的ssDNA探针（标记红色荧光染料或淬灭剂Iowa Black F）。
- 实验方法：
- 通过RNA电泳迁移率实验（REMSA）验证结合特异性（图1b）。
- 使用荧光光谱分析Spinachδ15与不同标记DNA探针（如5′-TMR、3′-JOE）结合后的淬灭效率（图1c）。
- 滴定实验测定结合亲和力（KD≈70 nM，图1d）及竞争实验验证体系可逆性（图1e）。
- 关键技术：设计灵活的连接区（linker）以优化染料取向，确保FRET效率（表S1）。

1. RNA-蛋白质相互作用的定量分析

   • 研究对象：Pseudomonas aeruginosa噬菌体衣壳蛋白PP7及其RNA结合序列（整合至Spinach的P3茎区，构建Spinach-PP7）。
     
   • 实验方法：
     
     • 对PP7蛋白进行半胱氨酸突变（A22C/A62C/N93C）并标记红色染料TF3，通过REMSA验证结合（图2b）。
       
     • 结构建模预测Spinach-PP7与PP7-TF3的距离（4.5–7.0 nm，图2a），荧光淬灭实验显示N93C突变体淬灭效率最高（65%，图2c）。
       
     • 滴定实验测定KD≈1.8 μM（图2d），竞争实验证明可逆性（图2e）。
       

2. 基因编码荧光蛋白的应用

   • 将PP7与红色荧光蛋白mCherry融合（mCherry-PP7），发现仅N端融合体能淬灭Spinach-PP7（20%效率，图3b）。KD测定为140 nM（图3c），显著低于化学标记蛋白，可能因mCherry体积增大导致距离限制。
     

3. 细胞裂解液环境验证

   • 在大肠杆菌裂解液中表达Spinach-PP7，加入mCherry-PP7后仍可观察到20%淬灭（图4），证明该方法在复杂体系中适用。

主要结果与逻辑链条
1. RNA-DNA杂交淬灭：5′端标记的DNA探针淬灭效率（85%）显著高于3′端（30–50%），证实距离依赖性（图1c）。结构建模显示5′端染料距Spinach发色团更近（图S1a）。
2. 蛋白-RNA相互作用：N93C-TF3的淬灭效率（65%）与建模最短距离（4.5 nm）一致（图2a, c），验证了FRET的取向和距离要求。
3. 基因编码标签的局限性：mCherry-PP7淬灭效率较低，但实现了完全基因编码的相互作用分析（图3），为活细胞应用奠定基础。

结论与价值
1. 科学价值：首次将Spinach适配体发展为FRET供体，建立了无需化学标记的RNA-蛋白质相互作用分析平台。
2. 应用价值：
- 方法学创新：通过Spinach淬灭实现均质化检测，简化了RNA相互作用研究流程。
- 潜在扩展：未来可优化荧光蛋白对（如Spinach与更匹配的受体）以提高活细胞成像信噪比。

研究亮点
1. 技术突破：首次证明Spinach可通过FRET被淬灭，填补了基因编码RNA荧光标记在相互作用研究中的空白。
2. 多层面验证：从核酸杂交到蛋白结合，从纯化体系到裂解液环境，系统性验证了方法的普适性。
3. 结构-功能关联：结合建模与实验数据，明确了淬灭效率与分子距离/取向的定量关系。

其他价值
- 支持信息：文中提供了详细的荧光染料光谱参数（表S2）、Spinach构建体特性（表S3）和蛋白标记位点距离数据（表S4），为方法复现提供标准参考。
- 可逆性验证：所有实验均包含竞争对照（如未标记DNA/PP7），证实信号变化源于特异性结合而非染料干扰（图1e, 2e, 3d）。

全文通过严谨的实验设计和多层次验证，为RNA生物学研究提供了一种高效、可逆且兼容活体环境的分析工具。