本研究由Nam Ngoc Pham等人完成，主要作者来自台湾国立清华大学化学工程系（Department of Chemical Engineering, National Tsing Hua University），合作单位包括台湾大学、长春集团（Chang Chun Group）和大连化学（Dairen Chemical Corp）。论文于2023年3月21日在线发表于*Metabolic Engineering*期刊第77卷，页码76–88。该研究属于代谢工程与合成生物学领域，聚焦于利用CRISPR系统对二倍体酵母*Candida viswanathii*进行理性基因组工程，以实现十二碳二酸（dodecanedioic acid, DDA）的高效生物合成。

研究背景与目的

DDA是一种含有12个碳原子的α,ω-二元羧酸，广泛用于生产高附加值尼龙-6/12、尼龙-12/12、涂料和油漆等。2015年DDA市场规模已达3.7亿美元，并以每年超过5.5%的速度增长。传统化学合成DDA需要高温高压、强酸和有毒氧化剂，对环境不友好。相比之下，生物转化法利用酵母的ω-氧化（ω-oxidation）途径将烷烃或脂肪酸转化为二元羧酸，具有条件温和、绿色可持续的优势。*C. viswanathii*是一种能够同化烷烃的酵母，在DDA生产性能方面表现最佳，但其代谢工程改造一直受限于合成生物学工具匮乏。该菌株具有二倍体基因组且不发生减数分裂，传统的同源重组基因操作效率低、步骤繁琐。此外，现有高产菌株多通过随机诱变获得，难以进行理性设计。因此，本研究旨在开发适用于C. viswanathii ATCC 20962的CRISPR基因编辑系统，并据此理性改造DDA生物合成途径，以提升DDA产量、摩尔转化率和生产强度。

研究流程与实验方法

研究总体可分为四个主要阶段：建立CRISPR系统、筛选关键酶、组合优化酶表达以及发酵验证。

在第一阶段，研究者首先筛选了6个内源启动子，发现*TDH1*启动子（PTDH1）活性最强，*PGK1*启动子（PPGK1）次之。因此，选择PTDH1驱动sgRNA表达，PPGK1驱动SpCas9表达。为了在Pol II启动子下有效加工sgRNA，研究者设计了三种核酶组合：Ham-HDV（HH）、tRNAAla-HDV（TH）和tRNAAla-tRNAGly（TTG），并将其置于sgRNA两侧。通过将线性化的CRISPR载体电穿孔转入ATCC 20962，以*ADE2*基因为靶点（其敲除后菌落呈粉红色）进行基因整合效率评估。结果表明，TH组合产生的粉红色菌落比例最高（约21–23%），说明tRNAAla-HDV核酶组合在*C. viswanathii*中加工sgRNA效率最佳。进一步分析发现，粉红色菌落为*ade2*双等位基因敲除（ade2−/−），而白色菌落为杂合型（ade2+/−）。为提高纯合整合效率，研究者优化了电穿孔后的恢复与筛选流程：将同源臂延伸至目标位点两侧各1 kb以诱导较大片段缺失，并在恢复培养基中补充必需氨基酸和腺嘌呤，同时在恢复4小时后加入25 mg/l诺尔丝菌素（nourseothricin, NRS）以增加选择压力，再继续恢复20小时后涂布于含NRS和腺嘌呤的平板。通过这一优化，纯合整合效率提高至60%以上。

在第二阶段，研究者系统筛选了参与ω-氧化途径的细胞色素P450单加氧酶（CYP）和NADPH-细胞色素还原酶（CPR）。从ATCC 20962基因组中扩增了*CYP52A13*、*CYP52A15*、*CYP52A18*、*CYP52A19*和*CPRB*基因，分别置于其天然启动子、十二烷诱导型启动子PCYP52A13或组成型启动子PTDH1/PPGK1下，构建一系列过表达质粒并转化至ATCC 20962。摇瓶发酵结果显示，过表达*CYP52A13*和*CYP52A15*不能提高DDA产量，而*CYP52A18*和*CYP52A19*在其天然启动子或PCYP52A13驱动下可显著提高DDA滴度，其中*CYP52A19*效果最佳。随后，研究者利用CRISPR系统将*CYP52A18*、*CYP52A19*或*CPRB*分别整合至*POX2*位点（该基因参与β-氧化途径），形成稳定工程菌株。摇瓶实验表明，整合*CYP52A18*或*CYP52A19*的菌株DDA产量分别达到11.1 g/l和11.9 g/l，显著高于亲本菌株的6.2 g/l。但单独整合*CPRB*或敲除*CYP52A13/14*、*CYP52A15/16*均未提高DDA产量。此外，所有菌株在12小时均出现中间产物12-羟基十二烷酸（HDA）积累，提示HDA氧化为DDA的步骤可能成为限速步骤。

在第三阶段，研究者进一步组合优化酶表达。共表达*CYP52A18*和*CYP52A19*的菌株DDA滴度并未超过单独表达*CYP52A19*的菌株，但共表达*CYP52A19*和*CPRB*的菌株（p-19c）DDA产量提高至15.1 g/l，且HDA积累显著降低至0.1 g/l。在3升发酵罐中，p-19c菌株的DDA滴度达到156 g/l，摩尔转化率为59%，生产强度为1.3 g/l/h，均比亲本菌株提高约41%。然而，发酵后期仍出现HDA积累，说明HDA氧化步骤仍需加强。为此，研究者引入长链醇氧化酶（FAO2），该酶可催化ω-氧化途径中的第二步和最后一步氧化反应。由于p-19c质粒过大（约18.9 kb），难以直接克隆*FAO2*，研究者开发了一种split CRISPR系统，将待整合的DNA分为两个共享约400 bp重叠序列的线性片段。第一个片段s-19c包含SpCas9、靶向*POX2*的sgRNA以及*CYP52A19*和*CPRB*表达盒；第二个片段包含*FAO2*表达盒。两个片段分别与*NRSR*标记基因的不同部分融合，共电穿孔后通过体内同源重组和CRISPR介导的位点特异性整合实现三基因共整合，同时只有完整整合的细胞才能获得NRS抗性。通过筛选不同启动子驱动*FAO2*的菌株，发现使用*POX4*启动子的菌株（pf19c）DDA产量最高，摇瓶达到17.9 g/l。在3升发酵罐中，pf19c菌株DDA滴度进一步提升至170 g/l，HDA几乎检测不到，摩尔转化率为63%，生产强度为1.42 g/l/h。

在第四阶段，研究者针对氧化反应消耗大量NADPH的问题，筛选了多种NADPH再生相关酶，包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶1（GDP1）、NADH激酶POS5以及细菌转氢酶PNTA/PNTB。将各酶表达质粒分别转化至pf19c菌株，摇瓶实验显示只有过表达*POS5*能进一步提高DDA滴度至18.9 g/l。研究者认为，由于CYP、CPR和FAO2均定位于内质网或线粒体膜，POS5在线粒体膜上再生NADPH可能更有利于氧化反应的辅因子供给。在此基础上，利用split CRISPR系统将*CYP52A19*、*CPRB*、*FAO2*和*POS5*四个基因（总长度13.6 kb）一次性整合至ATCC 20962的*POX2*位点，获得稳定菌株pfp19c。在3升发酵罐中，pfp19c菌株DDA滴度在120小时达到224 g/l，摩尔转化率高达83%，生产强度为1.87 g/l/h，且未检测到DA和HDA等中间副产物。相比亲本菌株，DDA滴度、摩尔转化率和生产强度均提高约一倍。

结论与意义

本研究成功开发了适用于C. viswanathii ATCC 20962的高效CRISPR基因编辑系统，特别是通过优化核酶组合和恢复筛选流程，将双等位基因纯合整合效率提高至60%以上。更重要的是，研究设计了一种新型split CRISPR系统，通过分裂选择标记基因实现多个基因在单次电穿孔中的一步整合，无需反复同源重组和标记基因回收，极大简化了二倍体酵母的代谢工程操作。在应用层面，通过理性组合表达*CYP52A19*、*CPRB*、*FAO2*和*POS5*，工程菌株pfp19c的DDA产量达到224 g/l，显著优于亲本菌株和多数已报道菌株，展示了该系统在长链二元羧酸生物制造中的巨大潜力。

研究亮点

本研究的亮点包括：第一，首次在*C. viswanathii*中建立了基于tRNAAla-HDV核酶组合的高效CRISPR系统，实现了双等位基因高效整合；第二，开发了无需融合结构域的split CRISPR系统，可一步整合至少4个基因（13.6 kb），为二倍体酵母的多基因代谢工程提供了新工具；第三，系统筛选了CYP52A家族和CPR酶，发现*CYP52A19*和*CPRB*共表达能有效解除ω-氧化第一步限速瓶颈；第四，揭示了*FAO2*在消除HDA积累中的关键作用；第五，首次发现线粒体定位的POS5在DDA合成中比胞质NADPH再生途径更有效，为优化氧化还原辅因子供给提供了新思路。这些发现不仅推进了*C. viswanathii*作为DDA生产底盘菌株的理性改造，也为其他二倍体酵母的代谢工程提供了可借鉴的策略。