本研究由来自AI Proteins公司的Edson N. Cárcamo Noriega与Christopher D. Bahl等研究人员完成，同时Christopher D. Bahl还隶属于哈佛医学院丹娜-法伯/波士顿儿童癌症与血液疾病中心。该研究成果发表于*Protein Science*期刊，2026年第35卷，文章编号e70746，DOI为10.1002/pro.70746。研究报道了一种基于高效蛋白酶洗脱的新型高通量蛋白质生产纯化平台，成功解决了长期以来制约重组蛋白纯化通量的核心技术瓶颈。
随着人工智能技术在蛋白质设计领域的迅猛发展，蛋白质的获取与表征已成为制约整个领域进步的瓶颈环节。传统的亲和层析纯化方法，尤其是固定化金属亲和层析（IMAC），虽然广泛应用于多聚组氨酸标签（His标签）融合蛋白的纯化，但高浓度咪唑洗脱方式存在三大局限：首先，咪唑在竞争性洗脱目标蛋白的同时，也会释放非特异性结合于树脂的宿主细胞蛋白，导致洗脱产物纯度下降；其次，在多孔板批量操作模式下，IMAC处于平衡结合状态，单次咪唑洗脱难以完全释放目标蛋白，多次洗脱降低了整体产率并增加了操作时间与试剂消耗；第三，洗脱液中含有高浓度咪唑，往往干扰下游的酶活性测定、生物活性分析、蛋白质相互作用研究以及圆二色光谱等表征实验，因此必须进行额外的缓冲液置换或脱盐步骤，进一步增加时间成本并降低产量。
亲和标签本身也可能干扰融合蛋白的活性、稳定性或溶解性。因此，通常引入特异性蛋白酶切位点以去除标签，但传统方法仍需额外的纯化步骤来移除切下的标签与蛋白酶。蛋白酶介导的洗脱策略长期以来被视为亲和纯化的理想替代方案，然而该策略面临两个相互矛盾的技术障碍：若用于洗脱的蛋白酶不带有与重组蛋白相同的亲和标签，则蛋白酶会污染洗脱产物；若蛋白酶带有相同标签，则会被树脂捕获，导致酶对底物的可及性受限，洗脱效率极低。自裂解内含肽系统虽然可在树脂上实现标签去除，但其对缓冲条件要求苛刻、裂解动力学缓慢且可能提前裂解，在高通量工作流中应用受限。
针对上述问题，本研究旨在开发一种高效蛋白酶洗脱方法，并以此为核心，构建一套端到端的DNA到蛋白质高通量生产工作流，以满足自动化液体处理平台的需求，同时确保方法的广泛适用性与可重复性。
1. 固定化蛋白酶构建体的设计与表征
研究团队首先提出假设：亲和标签捕获限制了蛋白酶对底物的可及性。为解决这一问题，他们在亲和标签与蛋白酶结构域之间插入了一段长而无序的蛋白质连接子。具体而言，他们选择了来自*Paramacrobiotus richtersi*的26.4 kDa蛋白CAHS_107838作为连接子，该蛋白已被核磁共振波谱验证为天然无序蛋白，且不含未配对半胱氨酸等不利因素。蛋白酶方面，研究团队选用了来自*Chaetomium thermophilum*的SUMO蛋白酶同源物（cth），该酶较酿酒酵母Ulp1具有更高的热稳定性、溶解性和约4倍的Vmax，同时保持对SMT3标签的特异性识别能力。亲和捕获系统采用10×His标签与镍-次氮基三乙酸磁性微珠。测试底物为超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），可通过荧光强度进行定量。
研究人员表达并纯化了三种cth SUMO蛋白酶构建体：无亲和标签型、N端10×His标签型、以及N端10×His标签后接CAHS_107838连接子型。通过将底物10×His-SUMO-sfGFP预载于Ni-NTA磁性微珠，加入150 nM蛋白酶室温孵育，以510 nm处荧光强度定量洗脱液中sfGFP含量，并与400 mM咪唑洗脱结果进行对比。结果显示，无标签蛋白酶可在30分钟内完成超过90%的底物释放，但会污染洗脱液；10×His标签蛋白酶活性严重受限，30分钟仅释放约10%底物，100分钟时约25%；而带有连接子的构建体在30分钟内几乎实现完全洗脱，且通过SDS-PAGE未检测到蛋白酶污染。该构建体被命名为“AIP protease”。研究还测试了300 nM和600 nM蛋白酶浓度，未观察到洗脱动力学的显著差异，但高浓度标签蛋白酶会导致未裂解底物和裂解后10×His标签SUMO的污染，因此选择150 nM作为最优浓度。
2. DNA组装与转化
基因组装采用Golden Gate Assembly策略，利用BsaI II型限制性内切酶进行无缝克隆。优化后的反应条件为：质粒与插入片段摩尔比1:3，37℃孵育60分钟，随后60℃孵育10分钟以灭活T4连接酶并线性化未插入片段的载体DNA。表达质粒pAIP4基于pet29b(+)改造，N端融合包含翻译起始序列MAKIH、10×His标签、SUMO标签（SMT3）以及BsaI克隆位点，C端引入双终止密码子。插入蛋白的N端和C端分别加入Ser-Gly疤痕序列以确保SUMO蛋白酶切割的广泛兼容性。
为绕过单克隆表达菌株的繁琐制备流程，研究者开发了将Golden Gate Assembly反应产物直接转化至表达菌株Lemo21(DE3)并进行液体培养的方案。通过纳米孔测序分析转化后的菌群，证实超过95%的构建体含有正确的基因插入，未检测到显著突变或插入缺失，且未发现无插入片段的质粒。通过梯度稀释法测定菌落形成单位，确定约188 CFU足以可靠地启动1 mL起始培养物并生长至饱和，而研究选择转化条件以达到约900 CFU，以提高对合成错误或异常组装的耐受性。
3. 蛋白表达培养
研究团队比较了ZYM-5052标准自诱导培养基与基于Terrific Broth改良的TBM-5052培养基。结果显示，TBM-5052在生物量积累和总蛋白产量方面均优于ZYM-5052。培养容器采用24深孔方孔板，以平衡平行处理能力与培养体积。通过共变培养体积与振荡速度，发现2 mL培养基配合800 rpm轨道振荡（3 mm轨道直径）为最优条件，在保证充分通气的同时避免培养基溅至透气封膜上。以10×His-SUMO-sfGFP为报告蛋白进行的96次重复实验显示变异系数低于5%，证实了工作流的高重现性。表达条件为25℃培养16至24小时。
4. 蛋白提取
研究比较了超声破碎与去垢剂裂解两种细胞破碎方法。以正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷为裂解剂，在高达2%（wt/vol）浓度下，超声破碎在所有测试条件下均显示出更高的裂解效率。去垢剂处理的样品黏度增加，干扰澄清和移液操作，且易产生持久性泡沫，不利于自动化处理。最终确定采用24针尖喇叭超声仪进行细胞破碎。优化的裂解条件为：细胞沉淀重悬于2 mL含溶菌酶、全能核酸酶和EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中，进行10个循环的超声处理（30秒开、30秒关，50%振幅），期间将24孔板置于冰水浴中以控制温度低于15℃。
5. 蛋白纯化
纯化采用Ni-NTA磁性微珠配合24孔磁力板进行批量操作。通过装载不同量的磁性微珠并监测捕获动力学，确定12.5 μL磁性微珠足以捕获约250 μg可溶性10×His-SUMO-sfGFP，30分钟足以实现接近完全的捕获。高通量方案选用4倍量（50 μL）磁性微珠以确保高达约1 mg蛋白的结合容量。纯化流程包括：澄清裂解液与磁性微珠孵育30分钟以上、以IMAC洗涤缓冲液（500 mM NaCl，20 mM咪唑，20 mM NaPi pH 7.4）洗涤三次、以PBS（pH 7.4）洗涤一次去除残留咪唑，然后重悬磁珠于500 μL含150 nM AIP protease的PBS中，室温振荡孵育约2小时进行柱上酶切。最终将洗脱液从四个24深孔板转移合并至一个96深孔板。
6. 自动化平台
研究团队为Beckman Coulter Biomek i7液体处理平台开发了涵盖基因组装、细菌转化、培养接种、蛋白纯化和后处理样品制备五个关键步骤的自动化协议。推荐配置包括双臂结构（1 mL 96通道移液头和Span-8移液器）、旋转式微孔板抓取器、网格化台面布局，以及加热/冷却模块、振荡模块和自动化热循环仪等在线设备。所有自动化脚本和实验数据均在CC-BY-NC-SA 4.0许可下公开。
基准集高通量纯化结果
为评估方法的普适性，研究团队构建了一个包含95个独特蛋白（另加sfGFP作为阳性对照）的基准集。选择标准包括：单结构域、结构已存入蛋白质数据银行（PDB）、不含二硫键、来源于中温生物、且曾在大肠杆菌中成功表达。基准集的成对TM-align平均得分为0.28，67%的蛋白对低于0.3的阈值，表明具有不同的折叠类型。79个具有CATH超家族注释的蛋白代表了64个超家族，香农熵为4.06（理论最大值的97.5%），辛普森多样性指数为0.018，证明基准集具有高度结构多样性。
以三个重复使用完整工作流生产基准集，从接收线性DNA片段到获得纯化蛋白的整个过程在3天内完成。成功标准定义为：从2 mL培养物中获得总量超过100 μg的纯化蛋白，且通过SDS-PAGE评估纯度超过90%。按照该标准，96个基准蛋白中成功生产了87个（成功率超过90%）。
蛋白酶底物偏好问题及解决方案
在纯化过程中，研究团队发现部分蛋白的cth SUMO蛋白酶消化效率较低，但与切割位点相邻氨基酸的种类无相关性，推测与底物蛋白p1’和p2’残基的三级结构环境有关。通过在异源蛋白N端引入Ser-Gly“疤痕”序列，在切割位点与蛋白结构域之间提供额外的空间，成功挽救了这些底物的蛋白酶活性。因此，所有构建体均包含N端SG疤痕以确保广泛的兼容性。
纯化蛋白的质量表征
对87个成功纯化的蛋白进行了系统的生物化学和生物物理表征。差示扫描荧光法（DSF）分析显示，68个蛋白（78%）表现出协同性解折叠转变，可计算解链温度。分析型尺寸排阻色谱（SEC）显示，53个蛋白呈单分散行为，呈现单一对称峰，表明为正确折叠且未聚集的物种；仅12个蛋白表现出宽峰或保留时间改变，提示部分寡聚化或构象异质性，这在高结构多样性的基准集中并不意外。圆二色光谱（CD）分析显示，64个蛋白（74%）的光谱特征与PDB中记录的二级结构组成一致，以α-螺旋为主的蛋白在208 nm和222 nm附近呈现特征性负峰，以β-折叠为主的蛋白在218 nm附近呈现特征性负峰，混合拓扑结构的蛋白则呈现208至222 nm之间的宽而平坦的负峰。部分蛋白因含有较高比例的无序区域而缺乏CD信号。
本研究成功开发了一种基于高效蛋白酶洗脱的高通量蛋白质生产纯化平台。通过在亲和标签与蛋白酶结构域之间引入长的天然无序蛋白连接子，巧妙地解决了固定化蛋白酶对底物可及性受限的难题，实现了与化学洗脱相当的洗脱效率，同时避免了蛋白酶或化学试剂的污染。以该AIP protease为核心，研究团队对整个DNA到蛋白质工作流进行了系统性优化，包括Golden Gate Assembly直接转化绕过克隆筛选步骤、自诱导培养基优化、高通量超声破碎以及磁珠批量纯化等，实现了96个蛋白在3天内从DNA到纯化蛋白的完整流程。
该研究的科学价值在于：为高通量蛋白质生产提供了一种通用、可靠且可自动化的解决方案，打破了长期以来限制蛋白质科学发展的技术瓶颈。应用价值体现在多个方面：首先，该方法与标准液体处理机器人广泛兼容，降低了高通量蛋白质生产的技术门槛和成本；其次，基准集的96个蛋白及其完整的表征数据（DSF、SEC、CD等）以标准化、带标签的数据集形式公开，可供计算分析和机器学习使用；第三，所有质粒材料已提交至Addgene，自动化脚本和实验流程在GitHub上以宽松许可公开，为其他研究人员开发或评估蛋白质表达纯化方法提供了宝贵的资源基础。该平台有望推动蛋白质工程、结构生物学、药物发现等领域的高通量研究进程。
本研究的核心创新点在于：第一，利用长的天然无序蛋白CAHS_107838作为连接子，在保持蛋白酶亲和捕获能力的同时，极大地提高了酶对固定化底物的可及性，实现了高效柱上酶切，这一策略为解决固定化酶催化效率问题提供了新思路。第二，将Golden Gate Assembly反应产物直接转化至表达菌株并直接进行液体培养，绕过了传统克隆筛选和单克隆验证的繁琐步骤，同时通过测序和条件优化确保了转化菌群的基因正确率超过95%。第三，构建了具有高度结构多样性的96蛋白基准集，并完成了系统的质量表征，为高通量蛋白质生产方法的标准化评估提供了重要参考。第四，整个工作流从DNA到纯化蛋白仅需3天，且兼容自动化液体处理平台，显著提升了蛋白质生产的通量和可重复性。