基于T7复制体的正交DNA复制系统在大肠杆菌中实现连续超突变与加速进化

作者及机构
本研究由Christian S. Diercks、Philipp J. Sondermann、Cynthia Rong、David A. Dik、Thomas G. Gillis、Yahui Ban和Peter G. Schultz共同完成，主要来自美国斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute）化学与斯凯格斯化学生物学系，以及加州生物医学研究所（Calibr）生物学系。通讯作者为Christian S. Diercks和Peter G. Schultz。该研究以预印本形式发布于bioRxiv（2024年7月25日），尚未经过同行评审。

学术背景
本研究属于合成生物学与定向进化领域，旨在解决传统定向进化技术的局限性。传统方法依赖体外诱变（如易错PCR）和宿主转化，耗时且通量低。尽管已有通过宿主DNA聚合酶改造或修复机制破坏提升突变率的尝试，但这些策略受限于宿主基因组必需基因的保真性要求，难以实现高效靶向诱变。正交复制系统（orthogonal replication system）通过外源复制体（replisome）维持独立复制子（replicon），可突破宿主限制，但现有系统（如OrthoRep和EcoRep）在大肠杆菌中突变率提升有限（仅比基因组高2-3个数量级），且转化效率低。本研究基于噬菌体T7复制体，开发了一种高突变率（1.7×10⁻⁵ substitutions per base, spb）、高转化效率（2.4×10¹⁰ cfu/μg）的正交复制系统，为连续进化提供了新工具。

研究流程与实验设计
1. T7正交复制系统的构建
- 复制体设计：T7噬菌体复制体包含T7 RNA聚合酶（gp1）、DNA聚合酶（gp5）、解旋酶/引物酶（gp4b）和单链DNA结合蛋白（gp2.5）。研究团队在大肠杆菌BW25113中通过质粒表达这些蛋白，并优化了复制起始机制：
- 将T7溶菌酶（gp3.5）的催化失活突变体（C131S）与T7 RNA聚合酶融合，以增强复制起始效率。
- 选用次级复制起点φOR替代原生起点，因其对溶菌酶的响应更强。
- 采用外切酶缺陷型T7 DNA聚合酶突变体（δ28，即T7 Sequenase 2）作为基础框架。
- 功能验证：通过T7噬菌体基因敲除株感染实验验证外源蛋白功能，并通过定量PCR测定复制子拷贝数（8.5拷贝/细胞）。

1. T7 DNA聚合酶的定向进化

   • 突变策略：针对DNA聚合酶的三个保真机制（碱基选择、外切酶校对、宿主错配修复），分阶段引入突变：
     
     • 外切酶域改造：δ28突变（28个氨基酸缺失）使突变率提升25倍（3.31×10⁻⁸ spb）。
       
     • 活性位点改造：通过同源比对筛选11个关键位点（如O-helix的N520M、铰链区P560V、复制叉接触位点V443K），构建单点饱和突变库，利用TEM-1 β-内酰胺酶的反向选择（reversion assay）筛选高突变变体。最佳三重突变（N520M/P560V/V443K）使突变率达1.04×10⁻⁵ spb。
       
     • 随机诱变优化：在五重突变体（Y24F/Q585R加入）中实现最终突变率1.73×10⁻⁵ spb（比宿主基因组高100,000倍），且不影响宿主基因组稳定性（基因组突变率3.9×10⁻¹⁰ spb）。
       

2. 连续进化验证：TEM-1 β-内酰胺酶的底物扩展

   • 实验设计：将TEM-1基因克隆至T7复制子质粒，在五重突变体（T7rep-7）中连续传代6天，抗生素浓度逐步提升（最高1000倍）。针对四种β-内酰胺类抗生素（单环菌素aztreonam和头孢菌素cefotaxime/ceftazidime/cefepime）进行96孔板平行进化。
     
   • 突变分析：通过Sanger测序和纳米孔扩增子测序追踪突变轨迹。结果显示：
     
     • 头孢噻肟（cefotaxime）：早期富集G238S（增强水解活性），后期伴随E104K和启动子突变（提高表达量）。
       
     • 头孢他啶（ceftazidime）：R164H/S和E240K组合增加活性位点容纳大侧链的能力。
       
     • 保守突变：M182T（稳定蛋白结构）和启动子突变在多组实验中重复出现，与临床耐药突变谱高度一致。
       

主要结果与逻辑关联
- 复制系统稳定性：T7复制子质粒可稳定维持2周以上，宿主生长速率（倍增时间29分钟）和密度（OD₆₀₀=7.2）未受影响（图1e-f）。
- 突变率梯度提升：从δ28单突变到五重突变，突变率提升525,000倍，证明活性位点改造是突破宿主保真限制的关键（图2c）。
- 进化效率：一周内获得对单环菌素和头孢菌素耐药性提升1000倍的TEM-1变体，重现了临床数十年观察到的突变路径（图4），验证了系统的高通量进化能力。

结论与价值
1. 科学价值：首次在大肠杆菌中实现与酵母OrthoRep相当的突变率（10⁻⁵ spb），且兼具细菌培养优势（更快生长、更高密度）。
2. 技术创新：
- 通过T7溶菌酶-RNA聚合酶融合调控复制起始，解决了外源复制体毒性问题。
- 解旋酶依赖的连续复制机制使环状质粒转化效率比线性系统（如EcoRep）高多个数量级。
3. 应用潜力：该系统可整合预构建突变库与连续诱变，适用于新功能酶（如非天然活性）、抗体或代谢通路的快速进化。

研究亮点
- 超高突变率：1.7×10⁻⁵ spb为目前大肠杆菌正交系统的最高记录。
- 全流程兼容性：环状质粒设计可直接对接标准分子生物学操作（如克隆、测序）。
- 进化轨迹解析：通过深度测序揭示了β-内酰胺酶适应性突变的动态累积过程，为耐药性机制研究提供模型。

其他价值
研究团队已就该系统申请专利，相关质粒可向作者索取。该系统未来或可替代需专用设备的连续进化技术（如PACE），推动合成生物学工具的普及化。