本研究由Yu-Hao Lin、De-Chen Qiu、Wen-Han Chang、Yi-Qi Yeh、U-Ser Jeng、Fu-Tong Liu以及Jie-Rong Huang等人完成，主要研究机构包括台湾阳明大学生物化学与分子生物学研究所、台湾同步辐射研究中心、台湾清华大学化学工程系以及台湾中央研究院生物医学科学研究所。该研究成果于2017年9月11日在线发表于《Journal of Biological Chemistry》，论文标题为《The intrinsically disordered n-terminal domain of galectin-3 dynamically mediates multisite self-association of the protein through fuzzy interactions》。

本研究属于结构生物学与生物物理化学领域，重点关注半乳糖凝集素-3（galectin-3）的自组装机制。Galectin是一类能够通过其保守的糖识别结构域（carbohydrate recognition domain，CRD）结合β-半乳糖苷的凝集素家族。在细胞外，galectin可以诱导细胞表面糖蛋白或糖脂发生聚集或形成晶格结构，从而调控细胞活化、迁移、黏附及信号传导等过程。已知哺乳动物中有15种galectin，其中14种具有二聚化或串联重复的CRD，从而获得多价性以执行功能。然而，galectin-3是该家族中唯一的嵌合型成员，其N端结构域（n-terminal domain，NTD）为内在无序区域（intrinsically disordered region），而C端为典型的CRD。Galectin-3在溶液中主要以单体形式存在，其功能多价性的实现机制一直存在争议。此前研究提出其可能通过NTD介导形成五聚体，但也有研究表明溶液中几乎检测不到寡聚体。因此，本研究的目的在于从残基层面阐明galectin-3通过NTD介导多位点自组装的结构与动态机制，并探索其与液-液相分离（liquid–liquid phase separation，LLPS）之间的关系。

本研究综合运用了核磁共振（NMR）波谱、顺磁弛豫增强（paramagnetic relaxation enhancement，PRE）、小角X射线散射（small-angle X-ray scattering，SAXS）、定点突变以及计算建模等多种技术手段。研究对象为全长galectin-3及其一系列截短突变体和半胱氨酸单点突变体。首先，研究者通过比较40 μM至400 μM不同浓度下的¹⁵N-¹H HSQC谱图，观察到若干交叉峰随浓度升高发生化学位移变化或强度减弱，尤其是CRD中残基约200–220（β链7–9）区域的变化最为显著。该区域位于糖结合位点的背面。40 μM与400 μM样本的峰强度比在NTD和CRD中分别约为0.13和0.25，而单纯由于浓度变化理论上应约为0.1，因此提示galectin-3在较高浓度下发生自组装。其次，研究者利用NMR自旋弛豫实验（纵向弛豫速率R₁、横向弛豫速率R₂和异核NOE）研究了不同浓度下蛋白质的动态特性。结果显示NTD较CRD更动态，且高浓度样本R₂更高、R₁更低，符合单体与更大分子之间平衡交换的特征。13C横向弛豫实验和CPMG弛豫弥散实验排除了化学交换对R₂增大的贡献。利用Model-free方法计算了CRD部分的广义序参数S²和内相关时间τᵢ，大部分S²约为0.8，τᵢ约为200皮秒，表明N–H键矢量运动快于整体翻滚速率。通过外推至零蛋白浓度，估算出CRD的旋转相关时间τc约为11.76纳秒，与利用HYCUD算法预测的11.84 ± 2.34纳秒一致，进一步支持40 μM时galectin-3基本以单体存在。随后，研究者对单独的NTD和CRD构建体进行了同样的NMR实验，发现CRD单独存在时无自组装迹象，而NTD单独存在时则表现出自组装倾向，说明全长蛋白中CRD区域化学位移的浓度依赖性变化依赖于NTD的存在。为了定位NTD中介导自组装的关键区段，研究者系统构建了Δ1–10、Δ1–20、Δ1–30、Δ1–40、Δ1–60、Δ1–80和Δ1–100等截短突变体。结果显示，Δ1–30的CRD平均ΔR₂值从全长蛋白的11.7 ± 1.9 s⁻¹下降至4.0 ± 0.9 s⁻¹，而Δ1–40至Δ1–100的ΔR₂值逐渐降低，表明残基20至100之间的多个区段均参与了自组装，这与其富含重复PGAX基序的特征一致。残基200–220的HSQC峰随着截短长度增加而逐渐移向CRD单独状态的位置，表明该区域在快速交换状态下与NTD发生多位点结合，即模糊相互作用（fuzzy interaction）。此外，Δ1–10和Δ1–20突变体表现出与全长蛋白相似或略高的自组装倾向，而残基200–220的峰反而更远离CRD单独状态位置，提示NTD最前端20个残基可能通过其负电荷残基（Asp-3和Asp-9）与CRD表面200–220区域的负电区域之间的静电排斥以及极性残基干扰疏水相互作用，从而抑制NTD与CRD的接触。SAXS实验显示全长galectin-3的回转半径（radius of gyration，Rg）约为28.92 Å，小于计算生成的无限制随机NTD构象系综的34.61 Å，而接近具有空间采样限制的模型系综的27.66 Å，支持NTD与CRD之间存在分子内模糊接触。为了进一步区分分子内和分子间相互作用，研究者进行了PRE实验，将MTSL自旋标记分别引入NTD的A10C、A31C、A49C和A100C位点以及CRD的I250C位点。在40 μM浓度下，氧化态与还原态MTSL样本的信号比接近1，表明几乎没有分子间相互作用；而在400 μM浓度下，NTD区域出现广泛的信号衰减，说明NTD与NTD之间存在分子间模糊相互作用；同时CRD中与糖结合位点相反一侧的β链2、7、8、9和11区域也有明显信号减弱，表明NTD与CRD之间存在分子间接触。I250C标记的PRE实验也显示NTD区域广泛信号衰减，进一步支持NTD与CRD之间的模糊接触。通过改变溶液条件，研究者发现加入100 mM NaCl或250 mM乳糖并不能显著抑制自组装，而加入0.8 M尿素后，高低浓度之间的ΔR₂值明显降低，残基200–220的HSQC峰位置也更接近CRD单独状态，表明疏水作用力是驱动自组装的主要因素。温度依赖性实验进一步支持这一结论，因为在较低温度下自组装减弱，符合疏水相互作用随温度升高而增强的规律。最后，研究者发现NTD以及模拟磷酸化突变体S6E均可发生温度依赖的液-液相分离，这与近年来发现的低复杂度结构域介导LLPS的机制相似。模糊相互作用可能促进蛋白质的可逆动态组装，并提高相互作用亲和力，从而帮助galectin-3在细胞表面形成多价晶格结构。

综合以上实验，本研究首次证明galectin-3通过三种相互作用实现自组装：分子内NTD–CRD相互作用、分子间NTD–CRD相互作用以及分子间NTD–NTD相互作用。这些相互作用均由疏水作用力驱动，并呈现模糊复合物的特征，即NTD中多个位点不确定地结合于CRD的残基200–220区域，而不存在唯一的结合界面。CRD单独存在时不能自组装，说明NTD的存在对于galectin-3的多价性至关重要。本研究的科学价值在于从残基水平阐明了galectin-3自组装的结构基础，调和了以往关于type-N与type-C自组装模式的争议，并提出了模糊相互作用介导多位点自组装的新模型。此外，galectin-3能够发生液-液相分离这一发现为理解其在细胞表面形成糖蛋白晶格、调控信号传导和细胞黏附等功能提供了新的视角，也为galectin-3相关疾病（如癌症、纤维化和炎症）中靶向干预策略的开发提供了潜在的理论依据。

本研究的亮点包括：首次在残基水平展示了galectin-3通过NTD介导的模糊自组装机制；结合NMR弛豫、PRE、SAXS和计算建模等多学科手段解析了无序蛋白的动态复合物；首次提出了galectin-3的液-液相分离现象与其自组装和功能多价性之间的联系。此外，研究中对NTD前端20个残基抑制自组装的发现也为理解galectin-3分泌调控和磷酸化修饰的生物学功能提供了新线索。