主要作者与机构
本研究由Yao Weng（冈山大学医学齿学药学研究生院口腔形态学系）、Ziyi Wang（冈山大学医学齿学药学研究生院分子生物学与生物化学系）、Heriati Sitosari（冈山大学及加查马达大学齿学院口腔生物学系）、Mitsuaki Ono（冈山大学医院口腔修复与种植科）、Hirohiko Okamura（冈山大学口腔形态学系）以及Toshitaka Oohashi（冈山大学分子生物学与生物化学系）共同完成。Ziyi Wang为第一通讯作者，Hirohiko Okamura为共同通讯作者。该研究得到了日本学术振兴会多项科研基金的支持（项目编号：19K09649、22F22114、22H03280、22H03511、22KF0265、23K18431）。论文于2024年6月11日投稿，2024年10月1日被接收，发表于*BioFactors*期刊2025年第51卷，文章编号e2131，由Wiley Online Library出版，版权归属于国际生物化学与分子生物学联合会（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）。
研究背景
O-GlcNAc糖基化（O-linked-N-acetylglucosaminylation）是一种可逆且动态的蛋白质翻译后修饰，其特征在于将尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺添加到胞质蛋白和核蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基上。这一过程由两种相互拮抗的酶介导：O-GlcNAc转移酶（OGT，o-glcnac transferase）负责添加糖基，而O-GlcNAcase（OGA）负责移除糖基。这种被称为“O-GlcNAc循环”的双向修饰机制在基因表达调控、细胞应激反应、胰岛素信号传导以及应对营养代谢的蛋白质稳定性维持中发挥着关键作用。已有研究表明，蛋白质O-GlcNAc糖基化水平的改变与多种骨相关疾病有关，包括骨质疏松症、牙周炎和骨关节炎。然而，O-GlcNAc糖基化调控骨生成（osteogenesis）的具体机制仍有待阐明。
线粒体作为细胞的“能量引擎”在营养代谢中扮演核心角色，近年来其在骨生成中的功能被广泛研究。线粒体是成骨细胞中矿物颗粒的主要来源，并且高度动态，持续进行分裂与融合的循环，这一过程被称为线粒体动力学（mitochondrial dynamics）。细胞骨架在调控线粒体动力学中的作用已经得到充分证实。此外，线粒体与内质网之间的偶联（mito–ER coupling）是线粒体动力学中的关键过程，该过程受VDAC和SERCA调控，两者都是富集于线粒体–内质网接触位点的关键钙离子通道，调控着线粒体与内质网之间的钙离子转运，从而影响成骨细胞分化。O-GlcNAc循环也大量存在于细胞骨架相关蛋白上，影响细胞骨架结构。尽管已有诸多认识，O-GlcNAc糖基化在骨生成过程中对线粒体与细胞骨架之间相互作用的影响仍鲜有报道。本研究旨在探索O-GlcNAc糖基化调控骨生成的潜在机制，重点关注其对线粒体、细胞骨架和内质网形态变化的影响，以及转录因子EZH2在这一过程中的潜在关键作用。
研究流程与方法
本研究的工作流程包括生物信息学分析、CRISPR/Cas9基因敲除细胞系的建立与成骨分化功能评估、细胞器形态学分析、人工智能模型训练与应用、低氧/氧化应激检测、RNA与蛋白表达分析以及统计学分析。
在生物信息学分析阶段，研究者重新分析了来自Gene Expression Omnibus（GEO）数据库的公开RNA-seq数据集GSE138783。该数据集被选用是因为其应用了OSMI-2和Thiamet-G分别抑制OGA和OGT，处理HEK-293T细胞。原始测序数据经过质量修剪后，使用STAR比对器比对到小鼠参考基因组（GRCm39，Ensembl release 105），通过StringTie进行从头转录本组装，并利用SQANTI3进行注释。使用Salmon软件进行转录本水平重新定量，IsoformSwitchAnalyzer进一步细化数据。显著差异表达基因（DEGs）使用DESeq2鉴定，标准为错误发现率（FDR）小于0.05且绝对log2倍数变化大于1。基因本体（Gene Ontology, GO）过表达分析使用clusterProfiler 4.0完成。此外，研究者对PubMed数据库进行了文献挖掘分析（literature mining），以识别与查询相关的基因。为了预测受O-GlcNAc糖基化调控的关键转录因子（TFs），研究者通过交叉引用TFLink、O-GlcNAcAtlas和Ensembl Variation数据库，构建了一个基因调控网络，包含来自前五个重叠的GO生物学过程条目的DEGs及其上游转录因子。
在细胞培养与基因敲除阶段，MC3T3-E1成骨样细胞在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基中培养，培养条件为37°C和5% CO₂。为诱导细胞分化，培养基中加入了50 μM抗坏血酸和2 mM β-甘油磷酸二钠。研究者使用CRISPR/Cas9系统建立OGT敲除（ogt-ko）细胞系。Cas9引导RNA（gRNA）设计靶向主要OGT转录本（OGT-201）的第七外显子。Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物通过电穿孔法导入MC3T3-E1细胞，使用NEPA21电穿孔仪施加特定电压脉冲。电穿孔后的细胞被稀释并在100 mm培养皿中培养，单个细胞长成细胞团后用克隆环分离。通过Western blotting检测OGT蛋白表达来确定敲除效率。对表达最低OGT的单克隆细胞株进行了ALP活性检测、茜素红S染色、von Kossa染色以及分化标志物（Dlx5、Sp7、Runx2、Bglap、Ibsp）的mRNA表达检测，同时进行了细胞增殖率测定。
在免疫荧光染色与形态学分析阶段，MC3T3-E1细胞在35 mm聚合物盖玻片底培养皿中培养，用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100通透，然后用Hoechst 33342标记细胞核、Alexa Fluor 546偶联的鬼笔环肽标记F-actin。免疫荧光成像分三批进行：第一批用Tom20抗体标记线粒体，第二批用Sec61β抗体标记内质网，第三批用α/β微管蛋白抗体标记微管。线粒体形态使用Fiji/ImageJ中的“Mitochondrial Analyzer”插件和Imaris软件中的“Spot”模型进行估计。F-actin/微管的形态使用Imaris软件中的“Filament”模型估计，细胞/细胞核/内质网的形态使用“Surface”和“Cell”模型估计。测量的参数包括细胞数量、线粒体数量、线粒体到细胞核的距离、线粒体体积、表面积、球形度、分支数量、分支长度、分支连接点数量、分支端点数量、分支直径、细胞/细胞核球形度（m1）、扁椭圆形度（m2）、长椭圆形度（m3）、F-actin/微管的丝状长度（fm1）、丝状体积（fm2）、分支点数量（fm3）、平均丝状直度（fm4）、平均节段直径（fm5）、平均节段长度（fm6）、内质网体积比（ER volume）以及细胞核微管蛋白共定位百分比（NTC）。线粒体–内质网偶联通过Pearson相关系数在共定位体素中估计。
在人工智能模型训练方面，研究者采用了一种基于PyTorch Fnet的无标记方法，通过卷积神经网络（CNN）从透射光图像直接预测三维荧光图像。该CNN模型使用配对的透射光和荧光显微镜图像数据集进行训练，能够学习这两种模态之间的复杂关系，无需实际荧光标记即可生成荧光图像。用于训练和测试AI模型的3D光学显微镜数据包括透射光的z堆栈和每种特定细胞结构的荧光染色。DNA用Hoechst 33342标记，F-actin用荧光鬼笔环肽标记，线粒体用Tom20免疫荧光染色标记，内质网用Sec61β免疫荧光染色标记。预测性能主要通过Pearson相关系数进行量化，基于独立测试集中每种结构（细胞核、F-actin、内质网和线粒体）的20对预测图像和对应的真实荧光图像进行计算。训练数据集由对照组和ogt-ko MC3T3-E1细胞8小时延时图像的终点图像组成。该模型随后被应用于相同的8小时延时图像以提高细胞结构预测准确性。
在低氧/氧化应激检测方面，由于O-GlcNAc糖基化已被报道对冷诱导产热和棕色脂肪组织线粒体生物发生至关重要，研究者评估了MC3T3-E1成骨样细胞在冷应激下的低氧状态和氧化应激。使用ROS-ID低氧/氧化应激检测试剂盒，活细胞以每皿80,000个的密度接种在35 mm聚合物盖玻片底培养皿中增殖24小时。细胞汇合后，将生长培养基更换为含有低氧（红色）和氧化应激（绿色）荧光探针的Hanks平衡盐溶液（HBSS），在95%湿度和5% CO₂条件下孵育30分钟。然后用冰冷的HBSS在1分钟内洗涤三次。稳定5分钟后，使用Keyence BZ-X710一体式荧光显微镜采集荧光产物和z堆栈透射光图像的延时图像，持续90分钟，间隔5分钟。
在RNA与蛋白收集及分子生物学分析阶段，RNA和蛋白从培养在60 mm培养皿中的汇合细胞中提取，使用PARIS试剂盒。细胞在冰上用PBS洗涤，用一次性细胞刮刀收集到冰冷的细胞裂解缓冲液中，分为RNA分离（120 μL）和蛋白分析（180 μL）两部分。RNA逆转录使用PrimeScript逆转录试剂盒，cDNA产物用纯水稀释8倍。Western blotting使用15 μg总蛋白进行SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2小时，一抗（1:1000）4°C过夜孵育，二抗（1:1000）室温孵育2小时。密度分析使用ImageLab软件进行。qRT-PCR使用Luna Universal qPCR Master Mix在LightCycler 96系统上进行，使用2⁻ΔΔCt方法计算基因表达差异，以Gapdh或β-actin为参考基因。
在统计学分析方面，由于方差分析（ANOVA）被认为对正态性违反具有“稳健性”，未对ANOVA数据进行正态性检验。对于多组比较，使用单因素ANOVA后进行错误发现率控制的多重比较检验。对于两组比较，使用Shapiro-Wilk检验检验正态性（α = 0.01），非正态分布数据使用Mann-Whitney检验，正态分布数据使用t检验。Pearson相关系数用于确定相关性强度。所有统计分析使用GraphPad Prism 8.0.0或R语言完成。
主要研究结果
生物信息学分析显示，通过重新分析GSE138783数据集中OSMI-2处理6小时和Thiamet-G处理6小时的RNA-seq结果，共鉴定出6935个差异表达基因（DEGs），其中4041个表达上调，2894个表达下调。在显著富集的GO生物学过程条目中，前五个一致的GO_BPs均与细胞骨架或线粒体相关，包括细胞骨架依赖性细胞内转运（GO:0030705）、细胞骨架依赖性胞质分裂（GO:0061640）、线粒体基因表达（GO:0140053）、微管细胞骨架组织调控（GO:0070507）和线粒体转运（GO:0006839），涵盖427个DEGs。通过文献挖掘，427个DEGs中有68个被识别为成骨细胞相关基因。这些DEGs受1216个转录因子调控，其中421个具有O-GlcNAc糖基化位点，113个经文献挖掘被识别为成骨细胞相关转录因子。值得注意的是，其中10个转录因子的O-GlcNAc糖基化位点与致病性单核苷酸多态性（SNPs）位于相同的氨基酸位置。基于这些数据构建了包含68个DEGs和10个转录因子的基因调控网络。
CRISPR/Cas9介导的OGT敲除实验表明，九个单克隆细胞株中有四个（#3、#6、#7和#9）在生长培养基中OGT蛋白表达显著下降，同时在分化培养基中Sp7、ALP、Bglap、Ibsp的mRNA表达下降，生长培养基中细胞增殖率降低。然而，矿化的显著下降仅在#6和#7单克隆中观察到，#3和#9中矿化增加可能与早期分化阶段Dlx5表达增加有关。Runx2的mRNA表达在对照组和ogt-ko细胞之间无显著差异。Sanger测序结果显示#6的DNA缺失长度最长且最为均一。因此，#6单克隆细胞株被用于后续所有实验。
形态学分析显示，ogt-ko细胞中每个视野（FOV）的细胞数量显著减少。有趣的是，ogt-ko细胞中线粒体比对照组更靠近细胞核。雷达图显示ogt-ko显著影响细胞形态、细胞核形态、F-actin、线粒体和内质网的形态，但仅影响微管的分布而非形态。具体而言，ogt-ko导致线粒体体积（mitom1）、表面积（mitom2）、分支数量（mitom4）、分支长度（mitom5和mitom6）、平均分支连接点数（mitom7）和平均分支端点数（mitom8）降低，同时线粒体球形度（mitom3）增加。然而，每个细胞的平均线粒体数量（mito no.）和平均线粒体分支直径（mitom9）保持不变。关于细胞骨架变化，ogt-ko降低了细胞球形度、细胞长椭圆度、核长椭圆度、F-actin体积和F-actin直径，但增加了细胞扁椭圆度、核扁椭圆度、F-actin直度和平均节段长度，而核球形度、每个细胞的F-actin总长度和F-actin分支点保持不变。ogt-ko未显著改变微管形态，但显著降低核微管蛋白（NTC）。
线粒体–内质网偶联分析显示，ogt-ko使Pearson相关系数显著降低约0.17。利用PyTorch Fnet AI模型从8小时延时透射光图像成功预测了细胞核、线粒体、F-actin和内质网结构。ogt-ko细胞表现出比对照组降低的运动性。与免疫荧光结果一致，AI预测的线粒体和内质网结构中Pearson相关系数在ogt-ko细胞中显著降低约0.20。此外，记录了四次有丝分裂事件（ogt-ko和对照组各两次），ogt-ko细胞在有丝分裂初期表现出降低的线粒体–内质网偶联。
冷应激后的低氧/氧化应激检测表明，ogt-ko细胞在冷应激处理后比对照组表现出更高的低氧水平和活性氧（ROS）水平。ogt-ko细胞中低氧水平的下降速率比对照组慢，而ROS水平的下降速率在两组之间无显著差异。因此，ogt-ko细胞中低氧/ROS比值增加，而对照组中降低。该比值仅在对照组中与线粒体–内质网偶联显著相关，ogt-ko细胞中无此相关性。双向ANOVA显示时间×ogt-ko的交互作用在低氧水平、ROS水平和低氧/ROS比值的变化中均显著，但“细胞”因素贡献了最大的总方差，分别占低氧水平26.19%、ROS水平27.37%和低氧/ROS比值66.78%，表明细胞异质性在冷应激氧代谢响应中不可忽视。
分子机制探索方面，Western blotting检测到对照组和ogt-ko细胞中有七个分离的O-GlcNAc条带。ogt-ko显著降低OGT蛋白表达以及Opa1、Hif1a和Hspa9的mRNA表达，而Git1、Gsk3a和Wnt3a的mRNA表达显著增加，Prkaa1的mRNA表达保持不变。Pearson相关矩阵显示，约95 kDa的O-GlcNAc条带（覆盖81–103 kDa片段）与OGT蛋白表达以及Opa1、Prkaa1、Git1、Gsk3a、Wnt3a、Hif1a和Hspa9的mRNA表达相关性最强。在10个上游成骨细胞相关转录因子中，EZH2（85 kDa）和STAT3（88 kDa）的分子量在95 kDa O-GlcNAc条带范围内。ogt-ko显著降低EZH2蛋白水平，而STAT3蛋白水平不受影响。EZH2蛋白表达与Opa1、Gsk3a、Wnt3a、Hif1a和Hspa9的mRNA表达显著相关，但与Prkaa1和Git1无显著相关。STAT3蛋白表达与上述基因的mRNA表达无显著相关性。
结论与意义
本研究证实了O-GlcNAc糖基化通过调控线粒体动力学和线粒体–内质网偶联在成骨细胞分化中发挥关键作用。研究发现ogt-ko细胞中成骨分化、运动性、增殖、线粒体–内质网偶联、内质网体积、核微管蛋白和氧代谢均显著降低。通过AI预测的细胞结构，延时活细胞成像结合ROS/低氧染色显示，ogt-ko细胞中较低的细胞增殖和改变的氧代谢与线粒体–内质网偶联相关。生物信息学分析结合mRNA和蛋白表达的相关性表明，EZH2及其下游靶基因（OPA1、GSK3A、WNT3A、HIF1A和HSPA9）可能参与O-GlcNAc糖基化调控的线粒体–内质网偶联，最终影响成骨细胞分化。
本研究的科学价值在于揭示了O-GlcNAc糖基化调节成骨细胞分化的新机制，将线粒体形态变化、细胞骨架重构和内质网结构与表观遗传调控因子EZH2联系起来。从应用价值角度看，鉴于线粒体在骨相关疾病中的治疗潜力，该基因调控网络中的其他线粒体相关节点值得进一步研究。过去几十年中，非人动物或人类心脏、肝脏、肺、脑和血液的体内线粒体移植已显示出对相关器官损伤或疾病的显著治疗潜力。本研究为通过靶向O-GlcNAc糖基化–EZH2