这项研究由北京大学农业与生命科学学院、生命科学学院的杨建国、向楠等团队与英国John Innes中心的Ray Dixon团队合作完成，成果于2023年8月16日发表在《PNAS》期刊（vol. 120, no. 34, e2305142120），题为《Organelle-dependent polyprotein designs enable stoichiometric expression of nitrogen fixation components targeted to mitochondria》。

学术背景

该研究属于合成生物学与植物工程学交叉领域，旨在解决禾本科作物生物固氮（biological nitrogen fixation）能力工程化的核心挑战。当前农业生产过度依赖工业氮肥，导致严重的经济和环境负担。虽然原核生物的固氮酶系统（nitrogenase）能将大气氮气转化为生物可利用氨，但将该系统引入真核生物面临两大瓶颈：一是固氮酶对氧极端敏感，需要特殊细胞区室保护；二是固氮酶由多个蛋白组分（如NifH、NifD、NifK等）按严格化学生量比组装而成，在真核细胞中难以实现协调表达。线粒体因其低氧环境和代谢特性，被认为是潜在的固氮酶定位场所。

研究方法与流程

研究团队开发了基于线粒体加工肽酶（mitochondrial-processing peptidase, MPP）的多蛋白（polyprotein）策略，主要分为五个阶段：

1. TEV蛋白酶系统的局限性验证
   在前期工作中，团队曾利用烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEVp）切割多蛋白链实现固氮组分在大肠杆菌中的协调表达。但将该系统应用于酿酒酵母线粒体时发现：TEVp表达导致酵母生长停滞（图1c），且线粒体靶向的多蛋白稳定性显著降低（图1b）。免疫印迹显示，未切割的多蛋白在胞质中降解，而TEVp在线粒体中的过表达可能引发蛋白毒性应激。

2. MPP最小切割序列的工程化设计
   通过知识导向的理性设计，团队系统筛选了神经孢子菌ATP合酶亚基9（su9）前导肽中的关键序列：

• 构建GFP-RFP报告系统，测试不同长度肽段（su9.30至su9.11）的切割效率（图2c）
  
• 鉴定出核心切割位点KRA↓YSS后，通过氨基酸替换优化出10肽序列RGGGRRA↓FHT（命名为s10），其双拷贝形式（2×s10）在酵母线粒体中切割效率最高（图2g）
  
• 发现C端FHT→FST突变（s10s）可进一步提升特定多蛋白（如NifENB）的加工效率（图3b）

1. MPP多蛋白系统在大肠杆菌中的功能验证
   将克雷伯氏菌固氮基因簇重构为5个多蛋白单元：
   

• NifHššDššK（结构蛋白）、NifUššS（金属簇组装）、NifJǐǐVǐǐW（电子传递）、NifFǐǐMǐǐY（辅因子合成）、NifEššN~B（FeMo辅因子合成）
  通过乙酰还原酶活性检测（acetylene reduction assay, ARA），该系统达到TEVp版本82%的活性（图3c）；当NifU/S单独表达时（版本2.1），活性提升至127%（图3c），并支持大肠杆菌的固氮生长（图3d）

1. 酵母线粒体中的化学生量表达调控
   通过启动子工程精细调节多蛋白表达：
   

• 使用误差倾向PCR改造启动子（如sa gal1.m1强度降至6%），使NifE表达量与大肠杆菌体系匹配（附图S7）
  
• 免疫印迹证实，优化后的菌株SC_3942中NifH/D/K/U等组分的化学计量比与天然体系一致（图4c）

1. 多蛋白策略的普适性验证
   将该系统拓展至其他代谢途径：
   

• 紫色杆菌素（violacein）：将VioA/B/E和VioD/C分别构建为多蛋白，在酵母线粒体中成功合成紫色色素（图5b），可溶性分析显示切割产物存在于可溶组分（图5d）
  
• 异丁醇（isobutanol）：通过基因排列组合优化，将Ilv5/3/2与AdhA/Aro10构建为多蛋白，产量达230 mg/L（图5f）

主要结果与科学意义

1. 技术突破：
   

• 创建的MPP多蛋白系统将固氮基因需求从16个减少至5个巨型基因，解决了真核细胞中多组分协调表达的难题
  
• 10肽切割序列（s10/s10s）比传统TEVp位点（54aa）更紧凑，避免跨细胞器运输前的预切割
  

1. 理论价值：
   

• 首次证明线粒体基质环境可支持复杂金属酶系统的组装，为细胞器合成生物学提供新范式
  
• 发现NifD-Y100Q突变能抵抗MPP降解（附图S4），揭示了蛋白稳定性与细胞器定位的分子互作机制
  

1. 应用前景：
   

• 为工程化固氮作物奠定基础，可能减少50%以上氮肥使用
  
• 多蛋白策略可推广至叶绿体、过氧化物酶体等细胞器，用于维生素、生物燃料等途径的区室化合成
  

研究亮点

1. 方法创新性：
   

• 开发不依赖外源蛋白酶的”自主切割”多蛋白系统，利用宿主内源MPP实现精准加工
  
• 通过启动子变异库与蛋白量化分析相结合，建立真核细胞中代谢途径的精细调控方法
  

1. 跨学科价值：
   

• 将原核生物固氮系统与真核细胞器生物学交叉融合，开辟合成生物学新方向
  
• 提供的MPP切割规则（-3R必需性、C端FST偏好性）丰富了蛋白质加工的理论认知
  

该研究仍存在未解问题，如线粒体中固氮组分的低溶解度（附图S9）及FeMo辅因子插入机制，未来可通过发掘极端微生物来源的耐热蛋白或引入分子伴侣进一步优化。