《Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics and Proteomics》2024年刊载的南美白对虾低温应激机制研究学术报告
一、研究团队与发表信息
本研究的通讯作者为Wenjun Shi与Xihe Wan，第一作者为Jianqiang Zhu（共同一作为Wenjun Shi），研究团队来自上海海洋大学国家渔业科学教育实验示范中心（中国上海）与江苏省海洋水产研究所（中国南通）。研究成果于2024年1月27日在线发表于Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics and Proteomics（期刊编号：1744-117X），文章标题为《Integrated physiological, transcriptome, and metabolome analyses of the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei under cold stress》。
二、学术背景与研究目标
科学领域：本研究属于水产动物生理学与分子生态学交叉领域，聚焦环境温度对甲壳类动物的生理与分子调控机制。
研究背景：
1. 温度对水产动物的限制性作用：温度直接影响水生变温动物的代谢酶活性、有氧呼吸及信号转导等生化过程，是决定物种分布与生长性能的关键环境因子。南美白对虾（*Litopenaeus vannamei*）作为全球主要养殖虾类，其最适生长温度为25–35°C，低于18°C时停止摄食，12°C为致死临界温度。
2. 现有研究的不足：尽管已有单组学（如转录组或代谢组）研究探讨低温对虾类的影响，但多组学整合分析仍缺乏，且基因-代谢物协同调控网络的机制尚不明确。
研究目标：
通过整合生理学、转录组学和代谢组学方法，系统解析南美白对虾肝胰腺在低温胁迫下的响应机制，揭示其增强耐寒性的调控通路，为虾类抗寒育种提供理论依据。
三、研究流程与方法
1. 实验设计与样本采集
- 研究对象：600尾健康南美白对虾（平均体重9.06 ± 0.23 g），经病原检测（如白斑综合征病毒WSSV）确认无感染。
- 温度梯度：从24°C（对照组CK）以2°C/2 h速率降温至12°C（T4），设置5个采样点（20°C/T1、18°C/T2、14°C/T3、12°C/T4），每个温度点稳定22小时后取样。
- 样本处理：
- 组织学分析：肝胰腺固定于10%中性福尔马林，石蜡切片后HE染色。
- 生理指标检测：测定甘油三酯（TG）、总蛋白（TP）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脱氢酶（LDH）等酶活性及抗氧化指标（MDA、SOD、CAT）。
- 多组学分析：转录组（Illumina HiSeq 6000测序）与代谢组（LC-MS/MS）样本于液氮速冻后保存于-80°C。
2. 转录组分析
- 测序与数据处理：9个文库共产生37.20–43.98 Mb原始数据，经Fastp过滤低质量 reads，Bowtie2比对至参考基因组（NCBI_GCA_003789085.1）。
- 差异基因分析：DESeq2筛选差异表达基因（DEGs，|log2FC|>1且FDR<0.05），STEM软件进行时序表达模式聚类。
- 功能注释：通过KEGG和GO数据库分析DEGs富集通路。
3. 代谢组分析
- 样本提取：80 mg肝胰腺组织用甲醇/乙腈（1:1）提取代谢物，LC-MS/MS（Agilent 1290 Infinity LC与AB Sciex TripleTOF 6600联用）检测。
- 数据分析：XCMS软件进行峰提取与注释，OPLS-DA模型筛选差异代谢物（DEMs，VIP≥1且p<0.05），KEGG通路富集分析。
4. 数据整合分析
- 多组学关联：将DEGs与DEMs映射至KEGG通路，构建基因-代谢物互作网络。
- qRT-PCR验证：随机选取10个DEGs（如CAT、HK、PK）进行表达量验证，β-actin作为内参。
四、主要研究结果
1. 低温胁迫下的生理与组织损伤
- 能量代谢重编程：
- 糖酵解增强：PK与LDH活性在12°C时显著升高（p<0.05），而SDH（有氧代谢标志酶）活性下降，表明能量供应从有氧代谢转向无氧糖酵解。
- 脂质消耗：TG含量随温度降低持续下降，12°C时达最低值（p<0.05）。
- 氧化损伤与免疫抑制：
- MDA含量在14°C和12°C时显著上升（p<0.05），而SOD活性在18°C达峰值后骤降，CAT与GPX活性持续降低，表明抗氧化系统在极端低温下崩溃。
- 免疫酶ACP与AKP活性显著降低（p<0.05），伴随肝胰腺组织结构破坏（如基底膜破裂、R细胞减少）。
2. 转录组与代谢组联合分析
- 关键通路调控：
- 氨基酸代谢：脯氨酸（Proline）、丙氨酸（Alanine）和谷氨酸（Glutamic acid）含量显著增加，相关基因（如BCAT2、AGXT2）表达变化支持其参与渗透调节与能量供应。
- 脂质代谢：不饱和脂肪酸（如油酸Oleic acid）积累，基因FASN与ACAC下调以减少能量消耗；磷脂酰丝氨酸（PS）合成基因PSS1上调，增强细胞膜流动性。
- 甲基化调控：S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAM-S）在初期低温（24→18°C）表达上调，促进甲基化以增强耐寒性，但在12°C时甲基化水平下降。
- 多组学网络：低温通过抑制胆汁酸转运基因SCP2导致牛磺胆酸（Taurocholate）积累，可能加剧肝胰腺损伤。
五、研究结论与价值
- 科学价值：首次通过多组学整合揭示了南美白对虾应对低温的分子-代谢协同网络，阐明了糖酵解激活、膜流动性调节及甲基化动态变化的核心机制。
- 应用意义：为虾类抗寒品种选育提供靶点基因（如BCAT2、PSS1），并为低温养殖管理策略（如饲料添加脯氨酸或牛磺酸）提供理论支持。
六、研究亮点
- 方法创新：结合生理指标、转录组与代谢组的三维分析框架，克服了单组学研究的局限性。
- 发现新颖性：
- 揭示了低温下甲基化水平的动态变化规律及其与耐寒性的关联。
- 提出PS与不饱和脂肪酸协同维持膜流动性的新机制。
- 应用潜力：鉴定出多个可干预的代谢节点（如L-肉碱合成通路），为抗寒饲料开发提供依据。
七、其他有价值内容
- 数据公开性：转录组数据已上传至NCBI SRA（编号PRJNA1010528），代谢组数据存于MetaboLights（MTBLS8646）。
- 伦理声明：实验符合中国实验动物管理规范，所有虾类操作均在冰麻醉下进行。