应用遗传学与分子生物技术提升产油酵母脂质生产：热带假丝酵母SY005的代谢工程改造
一、研究作者、机构与发表情况
本研究由印度理工学院卡拉格普尔分校（Indian Institute of Technology Kharagpur）生物技术系的 Atrayee Chattopadhyay、Anuja Gupta 和 Mrinal K. Maiti 共同完成。通讯作者为 Mrinal K. Maiti。该研究成果发表于 Springer-Verlag 旗下的学术期刊 Applied Microbiology and Biotechnology，文章于2020年4月17日收稿，经修订后于2020年8月11日正式接受在线发表（https://doi.org/10.1007/s00253-020-10830-6）。
二、研究的学术背景与目标
本研究的科学领域属于 微生物代谢工程 和 合成生物学，具体聚焦于 产油酵母（Oleaginous yeast） 的 脂质代谢工程（Lipid metabolic engineering）。产油酵母能够积累超过其细胞干重20%的脂质，是生产生物柴油和特种油脂的理想微生物细胞工厂。尽管解脂耶氏酵母（*Yarrowia lipolytica*）等模式产油酵母已被广泛研究，但 热带假丝酵母（Candida tropicalis） 因其独特的优势而日益受到关注：它不仅具有产油特性，还能高效利用多种碳源，如葡萄糖、木糖、蔗糖、乳糖、正构烷烃和脂肪酸等，这为其利用廉价工农业废弃物作为原料生产油脂提供了巨大潜力。
然而，将热带假丝酵母开发为高产脂质平台的瓶颈在于其 遗传转化系统 的不足。对于该酵母，特别是本研究使用的SY005菌株，缺乏稳定、高效的遗传操作工具。传统的转化方法多依赖于营养缺陷型筛选或抗生素抗性，对于二倍体酵母（如SY005）而言，同时敲除两个等位基因以构建稳定的营养缺陷型宿主费时费力。此外，缺乏适合的、来自宿主自身的可调控启动子和高效的基因组整合位点，也限制了其代谢工程改造的效率和可预测性。
因此，本研究旨在解决上述限制，具体目标包括：1）为热带假丝酵母SY005建立一个 无标记（markerless）的基因组整合转化系统；2）从SY005自身基因组中克隆并验证其特异的、可调控的启动子（gal1p）和转录终止子（act1t），并确定一个高效的基因组整合位点（rps10）；3）利用此系统，异位表达（ectopically express） 一个关键的转录因子基因 *ctRAP1*，该基因编码阻遏激活蛋白1（Repressor activator protein 1），以期在不施加营养压力或损害细胞生长的前提下，增强SY005菌株的脂质积累能力。最终目标是开发一个高效的基因操作平台，并验证通过调控转录因子来提升该产油酵母脂质产量的可行性。
三、详细研究流程
本研究包含一系列逻辑严密的实验步骤，从遗传工具开发到功能验证，再到表型分析和机制探讨。
1. 构建热带假丝酵母SY005的尿嘧啶营养缺陷型（Uracil auxotroph）菌株： 由于SY005是二倍体野生型菌株，研究首先需要创建一个稳定的选择性标记。研究者采用了 FLP/FRT可回收筛选标记策略。他们使用了一个来自白色念珠菌（*C. albicans*）的 sat1 flipper 盒式载体（pURA-del）。该载体包含：潮霉素抗性基因 *caSAT1*、受麦芽糖诱导的FLP重组酶基因 *caFLP*，以及两个FRT位点。最重要的是，该载体两端带有SY005菌株 URA3 基因的上游（5‘ UTR）和下游（3’ UTR）同源序列。通过电穿孔法将线性化的pURA-del片段导入SY005，利用同源重组将整个盒式载体整合到其中一个 URA3 等位基因位点，获得对诺尔丝菌素（Nourseothricin, Nat）抗性的杂合转化子（Heterozygous NatR）。随后，通过在含麦芽糖的培养基中培养，诱导FLP重组酶表达，介导FRT位点间的同源重组，从而精确切除了盒式载体中的 caSAT1 抗性标记，得到一个对Nat敏感但其中一个 URA3 等位基因已被破坏的杂合菌株（Heterozygous NatS）。将此过程重复一次，即可破坏第二个 URA3 等位基因，最终获得完全缺失 URA3 基因、且不携带任何抗生素抗性标记的纯合营养缺陷型菌株，命名为 ura-/-。每一步都通过PCR和Southern印迹杂交进行了验证。
2. 开发基于SY005特异性元件的整合型质粒系统： 为了在ura-/-菌株中进行可控的基因表达，研究者构建了整合型质粒 pCTINT1。该质粒的核心创新在于全部使用了来自宿主SY005自身的遗传元件： * 整合位点（Integration Locus）：克隆了SY005的 rps10 基因编码序列。该位点（核糖体蛋白S10基因座）在念珠菌属中已知能支持高效、稳定的基因组整合，并可避免位置效应（position effect）。 * 可调控启动子（Regulatable Promoter）：克隆了SY005的 gal1 基因上游约1.1 kb的推定启动子序列（gal1p）。该启动子预期受半乳糖诱导、受葡萄糖阻遏。 * 转录终止子（Transcription Terminator）：克隆了SY005的 actin 1 基因的转录终止子序列（act1t）。 质粒还携带了来自白色念珠菌的 URA3 基因作为在ura-/-宿主中的筛选标记。通过AgeI酶切线性化质粒，暴露 rps10 序列两端，可促进其通过同源重组精准整合到宿主基因组的 rps10 位点。
3. 验证遗传元件的功能： 在应用此系统表达目标基因前，需验证新克隆的gal1p和act1t的功能。研究者将 酵母增强型修饰红色荧光蛋白（yeast-enhanced modified red fluorescent protein, yemRFP） 的编码序列克隆到pCTINT1的gal1p和act1t之间，构建了报告质粒 pCTINTM1。将线性化的pCTINTM1转化ura-/-菌株，获得转化子 CTGMA。通过共聚焦荧光显微镜观察，在添加半乳糖诱导的培养条件下，CTGMA细胞发出了强烈的红色荧光，初步证明了gal1p的活性。进一步的 流式细胞术（Flow cytometry） 定量分析显示，在半乳糖培养基中生长24小时后，表达yemRFP的细胞比例最高；而在葡萄糖培养基中，荧光信号显著降低，这证实了gal1p启动子受半乳糖诱导、受葡萄糖阻遏的典型调控特性。这是首次在热带假丝酵母中成功表达红色荧光蛋白的报告。
4. 异位表达转录因子基因 ctRAP1 及工程菌株构建： 将SY005来源的 ctRAP1 基因编码序列克隆到pCTINT1的gal1p和act1t之间，构建了表达质粒 pCTINTR1。同样，将线性化的质粒转化ura-/-菌株，通过在不含尿嘧啶的培养基上筛选，获得稳定整合了 ctRAP1 表达盒的工程菌株，命名为 CTGRA。通过针对整合位点的特异性PCR，验证了表达盒已成功整合到基因组 rps10 位点。
5. 工程菌株的表型分析与脂质产量评估： * 基因表达水平分析：使用 定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription-PCR, qRT-PCR） 检测CTGRA菌株中 ctRAP1 的转录水平。结果显示，无论是在葡萄糖还是半乳糖培养基中培养48小时，工程菌中 ctRAP1 的表达量都较对照菌株（仅整合空载体）有数千倍的提升，其中半乳糖诱导下的表达量最高。 * 脂质积累可视化与定量： * 荧光染色与显微镜观察：使用尼罗红（Nile red）染色脂滴，并通过共聚焦显微镜观察。与对照相比，在半乳糖诱导下的CTGRA细胞内观察到更大、更密集的脂滴。 * 荧光分光光度法：定量测量尼罗红染色的荧光强度，作为脂质相对含量的指标。数据显示，CTGRA菌株在半乳糖诱导下培养72小时后，荧光信号最强。 * 重量法总脂提取与测定：采用经典的Bligh & Dyer氯仿-甲醇法提取总脂，并计算脂质含量（克脂质/克细胞干重）。这是最直接的脂质产量数据。 * 潜在机制初探：通过qRT-PCR检测了脂质合成通路中几个关键基因的表达，包括脂肪酸合成酶基因（fas1, *fas2*）、磷脂酸磷酸酶基因（*pah1*）和二酰基甘油酰基转移酶基因（*dgat*），以探索 ctRAP1 过表达促进脂质积累的可能分子机制。
四、主要研究结果及其逻辑关联
成功构建了无标记的ura-/-营养缺陷型宿主：PCR和Southern印迹结果清晰地证明了通过两轮FRT/FLP介导的重组，成功删除了SY005菌株的两个 URA3 等位基因，且最终菌株不遗留抗生素抗性标记。这为后续利用 URA3 进行筛选的整合转化奠定了安全、稳定的宿主基础。
建立并验证了一个高效、特异的基因组整合表达系统：报告基因yemRFP的表达实验成功验证了来自SY005自身的gal1p启动子具有预期的可调控活性（半乳糖诱导/葡萄糖阻遏），且act1t终止子功能正常。流式细胞术的数据提供了强有力的定量证据，表明该启动子在宿主细胞内工作高效且调控严谨。这标志着为热带假丝酵母SY005量身定制的遗传操作工具包开发成功。
工程菌株CTGRA实现了 ctRAP1 的高水平异位表达：qRT-PCR数据显示，在工程菌中，无论碳源如何，ctRAP1 的表达量都获得了极其显著的提升（半乳糖下超7600倍）。这直接证明了所构建的整合表达系统能够高效驱动外源（此处为同源但异位）基因的过表达。这一结果是连接“工具开发”与“表型获得”的关键桥梁。
*ctRAP1* 的过表达显著提高了脂质产量：这是本研究的核心发现。所有脂质检测方法的结果一致指向同一结论：
初步揭示了可能的分子机制：qRT-PCR分析显示，在 ctRAP1 过表达的工程菌中，多个下游脂质合成关键基因（fas1, fas2, pah1, *dgat*）的转录水平上调。这暗示 ctRAP1 可能作为一个全局调控因子，通过激活脂肪酸从头合成途径和甘油三酯（TAG）组装途径的相关基因，从而将碳代谢流导向储存脂质的合成。这为表型变化提供了合理的分子生物学解释，增强了结论的可信度。
整个研究的逻辑链条清晰：构建遗传工具 → 验证工具功能 → 应用工具过表达目标基因 → 获得预期表型 → 初步探索表型背后的机制。每一步的结果都为下一步提供了支撑和依据。
五、研究结论与价值
本研究成功开发了一个专为产油酵母热带假丝酵母SY005设计的、基于同源遗传元件的无标记基因组整合转化系统。利用该系统，研究者实现了转录因子基因 ctRAP1 的受控过表达，并最终使工程菌株的脂质含量提高了60%，达到了0.37 g/g DCW的高水平。
科学价值： 1. 方法论贡献：研究填补了热带假丝酵母，特别是SY005这一具有应用潜力的菌株，在遗传操作工具上的空白。所建立的系统（包括可回收标记敲除、宿主特异性启动子/终止子/整合位点的应用）为在该酵母乃至其他非模式产油酵母中进行精细代谢工程研究提供了可借鉴的范式。 2. 对脂质代谢调控的新认知：研究首次在热带假丝酵母中揭示了转录因子RAP1同源物（ctRAP1）在正向调控脂质积累中的重要作用，拓展了人们对产油酵母脂质代谢调控网络的理解。 3. “无压力”生产策略的验证：研究证明，通过基因工程手段调控内源性转录因子，可以在不施加氮限制等营养压力的条件下实现脂质产量的提升，这有助于避免传统发酵中因营养压力导致的细胞生长迟滞，可能有利于提高整体产率。
应用价值： 1. 工业菌株开发：工程化的CTGRA菌株展示了作为下一代微生物脂质原料的巨大潜力。其利用半乳糖等高产脂质的特性，为以乳清（富含乳糖，可水解为半乳糖和葡萄糖）等廉价原料生产油脂提供了新思路。 2. 平台价值：所开发的遗传改造平台可用于进一步优化SY005，例如过表达更多脂质合成通路基因、敲除竞争途径、或引入合成高值脂肪酸的途径，从而定制化生产生物柴油、特种油脂或油脂化学品。
六、研究亮点
七、其他有价值的内容
研究还展示了该转化系统在多方面的适用性：1）可用于报告基因（如yemRFP）表达，便于启动子活性分析或细胞标记；2）采用的FLP/FRT系统可实现标记的循环使用，适用于需要进行多轮基因编辑的复杂代谢工程。此外，文中详细描述的电穿孔转化条件、载体构建策略等实验细节，对后续从事类似酵母遗传学研究的科研人员具有很高的参考价值。最后，研究指出后续通过工艺优化（如发酵条件），该工程菌株在大规模脂质生产方面具有广阔前景，为从基础研究走向工业应用指明了方向。