这篇由Yu Zhao, Guanghao Guo, Yumei Sun等人（共同第一作者）以及Wentao Li（通讯作者）领导，来自华中农业大学动物医学院、农业微生物学全国重点实验室、湖北洪山实验室等机构的研究团队完成的原创性研究论文，于2025年8月发表于Journal of Virology（第99卷第8期）。

一、 学术背景

本研究属于病毒学与宿主-病原体相互作用领域，具体聚焦于猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）及其相关猪肠道冠状病毒（Swine enteric coronaviruses， SECoVs）。PEDV是造成全球养猪业巨大经济损失的重要病原体，尤其对新生仔猪致死率极高。然而，尽管该病毒被发现已超过40年，其复制所必需的宿主因子，特别是功能性细胞受体，依然不完全清楚。虽然氨基肽酶N（Aminopeptidase N， APN）曾被提出作为PEDV的潜在受体，但近年来的证据（例如APN敲除猪仍可感染PEDV）对此提出了挑战。因此，系统性地发现和鉴定调控PEDV感染的关键宿主因子，对于理解其致病机制、开发新型抗病毒策略至关重要。

近年来，基于CRISPR/Cas9的基因敲除筛选技术已成为发现病毒复制必需宿主因子的强大工具。然而，针对PEDV的此类研究多在使用非猪源细胞系（如Vero E6），可能存在物种差异带来的局限。此外，全基因组筛选虽然全面，但可能稀释了对膜蛋白（尤其是潜在受体）的聚焦。本研究团队旨在填补这一空白，他们计划构建一个靶向猪源细胞膜蛋白的亚基因组规模CRISPR/Cas9敲除文库，直接在猪源细胞中进行筛选，以期高效鉴定出对PEDV感染至关重要的膜蛋白，包括潜在的未知受体。

本研究的目标明确：1）开发一个针对猪膜蛋白的CRISPR敲除文库；2）利用该文库筛选鉴定PEDV感染所必需的宿主因子；3）对筛选出的关键因子进行深入的功能和机制研究；4）探索该因子在其他猪肠道冠状病毒感染中的作用，评估其作为广谱抗病毒靶点的潜力。

二、 详细研究流程

本研究流程设计严谨，环环相扣，可分为以下几个核心步骤：

第一步骤：文库构建与筛选。 团队首先从UniProt和Ensembl数据库中获取猪的膜蛋白编码基因信息，利用CRISPR-offinder软件为每个基因设计最多7个向导RNA（single-guide RNA， sgRNA）。最终构建了一个名为“猪膜蛋白规模CRISPR/Cas9敲除库”的文库，包含11,252个sgRNA，靶向1,607个膜蛋白相关基因，并包含200个非靶向对照sgRNA。该文库通过慢病毒转导方式导入稳定表达Cas9蛋白的猪肾细胞LLC-PK1中，构建了PK1-pigMPCKO突变细胞池。测序验证显示，95.59%的sgRNA在细胞库中得以保留，确保了文库的代表性。随后，研究团队利用表达绿色荧光蛋白的PEDV-GDU-GFP毒株（GII基因型），以高感染复数对该细胞库进行了两轮独立的感染筛选。病毒感染后存活的细胞被收集，通过PCR扩增和Illumina测序分析其中sgRNA的丰度变化。经过两轮筛选，他们比较了病毒感染组与对照组的sgRNA富集情况，鉴定出在病毒压力下显著富集的sgRNA及其对应的基因，意味着这些基因的敲除可能赋予了细胞对PEDV的抗性。

第二步骤：候选基因验证与靶点选择。 从筛选结果中，研究团队根据统计显著性（p值）和两轮筛选的重复性，确定了排名前列的候选基因。为了初步验证，他们选取了7个候选基因（包括RPSA和ROBO4等），在猪睾丸细胞系ST-Cas9中分别构建了单个基因的敲除细胞系。通过病毒滴度测定和免疫荧光等实验，他们发现敲除核糖体蛋白SA和ROBO4能显著降低PEDV的复制水平，而敲除其他候选基因则无此效果。鉴于RPSA（也称为层粘连蛋白受体1）在多种病毒（如登革热病毒、经典猪瘟病毒）中已被报道可作为受体或宿主因子，研究团队决定选择RPSA作为后续深入研究的焦点。

第三步骤：RPSA功能缺失与功能回补验证。 在ST-Cas9细胞中成功构建了RPSA基因敲除细胞系，并通过Western Blot和Sanger测序确认了敲除效率。细胞增殖实验表明RPSA敲除不影响细胞基本生长。功能验证实验显示，在不同感染复数和不同时间点，RPSA敲除细胞中的PEDV病毒滴度、病毒N蛋白表达水平均显著低于野生型细胞。为确证RPSa的作用，团队进行了功能回补实验：在RPSA敲除细胞中重新表达经过同义突变（以规避原始sgRNA切割）的RPSA蛋白，结果部分恢复了PEDV的复制能力。相反，在野生型细胞中过表达RPSA则增强了PEDV的复制。这一系列“敲低-回补-过表达”的实验，有力地证明了RPSA是PEDV复制所必需的宿主因子。

第四步骤：探究RPSA在病毒感染周期中的作用阶段。 为了明确RPSA是在病毒进入阶段还是复制阶段发挥作用，研究团队进行了精细的病毒附着和病毒内化实验。结果显示，与野生型细胞相比，RPSA敲除细胞对PEDV病毒的吸附和内化能力没有差异，初步排除了RPSA作为PEDV进入受体的可能性。进一步的共免疫沉淀实验也未能检测到RPSA与PEDV刺突蛋白之间的相互作用，支持了这一结论。为了确定RPSA是否影响病毒复制，他们使用链特异性实时定量PCR区分病毒正链和负链RNA的合成。发现在感染后4小时，RPSA敲除细胞中的正链RNA合成即受到抑制，而负链RNA的抑制出现在感染后6小时。同时，共聚焦显微镜观察显示，标志病毒基因组复制的双链RNA合成在RPSA敲除细胞中显著减少。透射电镜观察更直观地发现，RPSA敲除细胞中病毒颗粒的形成极为罕见。这些结果综合表明，RPSA敲除主要抑制了PEDV的基因组复制和病毒粒子组装阶段，而非病毒进入阶段。

第五步骤：机制探索——RPSA通过ERK1/2信号通路调控PEDV复制。 基于先前研究提示RPSA可能调控丝裂原活化蛋白激酶信号通路，而MAPK通路对PEDV复制很重要，团队着手研究其分子机制。Western Blot分析发现，在PEDV感染后，RPSA敲除细胞中细胞外信号调节激酶1/2的磷酸化水平显著降低，而JNK和p38的磷酸化水平未受影响。这表明RPSA特异性正调控ERK1/2通路。为了验证ERK1/2通路对PEDV复制的必要性，他们使用特异性抑制剂U0126处理细胞，发现抑制ERK1/2磷酸化能显著降低PEDV复制。最关键的是，挽救实验显示，在RPSA敲除细胞中使用ERK1/2激活剂ML-098或C16-PAF进行处理，可以部分恢复ERK1/2的磷酸化水平，并相应地恢复PEDV的复制。这些数据构成了一个完整的证据链：RPSA通过正调控ERK1/2信号通路的激活来促进PEDV复制。

第六步骤：机制探索——RPSA影响脂质代谢。 为了更全面地理解RPSA敲除如何抑制病毒复制，团队对感染和未感染的野生型及RPSA敲除细胞进行了RNA测序分析。转录组数据分析揭示，RPSA敲除显著影响了与脂质生物合成和脂质运输相关的多个基因的表达。基因集富集分析确认，在PEDV感染背景下，RPSA敲除导致固醇生物合成、甘油三酯生物合成等过程的基因表达下调。RT-qPCR验证了多个脂质合成和转运相关基因的表达变化。功能上，通过共聚焦显微镜观察和生化检测发现，PEDV感染会诱导细胞内脂滴积聚，以及总胆固醇和甘油三酯水平的上升，而这些效应在RPSA敲除细胞中被显著削弱。进一步的实验表明，抑制ERK1/2通路（使用U0126）也能减少PEDV诱导的脂质积聚，但其对脂质代谢相关基因的影响模式与RPSA敲除不完全相同，提示RPSA可能通过ERK1/2依赖和非依赖的多种方式调控脂质代谢。

第七步骤：扩展研究——RPSA对其他猪肠道冠状病毒的作用。 RNA-seq数据意外发现RPSA敲除显著下调了APN的表达，而APN是传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒的已知受体。这一发现将研究引向了更广谱的意义。实验证实，在RPSA敲除细胞中，APN的mRNA和蛋白水平均下降。相应地，TGEV和PDCoV在这类细胞中的复制也受到显著抑制。同时，在TGEV和PDCoV感染期间，RPSA敲除细胞中的ERK1/2磷酸化水平也降低。此外，研究还证明RPSA敲除对另一株PEDV GII亚型毒株的复制同样有抑制作用。这些结果表明，RPSA作为宿主因子，其作用可能不限于PEDV，而是对多种猪肠道冠状病毒具有广谱重要性。

三、 主要结果

1. 成功构建并应用猪膜蛋白CRISPR文库筛选出关键宿主因子。 经过两轮PEDV感染压力筛选，从1，607个膜蛋白基因中鉴定出多个候选基因，其中RPSA和ROBO4的敲除被验证能有效抑制PEDV复制。
2. 证实RPSA是PEDV复制所必需的宿主因子，但非其进入受体。 功能缺失和回补实验确证了RPSa的必要性。病毒附着/内化实验、抗体阻断实验、共免疫沉淀实验以及过表达实验均一致表明，RPSA不参与PEDv的细胞附着和进入过程。
3. 明确RPSA作用于病毒复制阶段。 链特异性RT-qPCR、dsRNA检测和透射电镜结果共同证明，RPSA敲除严重损害了PEDV的基因组复制、病毒粒子组装和释放。
4. 阐明RPSA通过正调控ERK1/2信号通路来促进病毒复制。 RPSA敲除特异性降低了ERK1/2的磷酸化；抑制ERK1/2活性可模拟RPSA敲除的抑制效果；激活ERK1/2则可挽救RPSA敲除细胞中的病毒复制缺陷。
5. 揭示RPSA调控PEDV感染诱导的脂质代谢重编程。 转录组学和生化分析表明，RPSA是PEDV诱导的脂质生物合成、转运和脂滴积聚所必需的。这部分机制部分依赖于ERK1/2通路。
6. 发现RPSA具有广谱抗冠状病毒潜力。 RPSA敲除通过下调APN表达和抑制ERK1/2信号，不仅抑制PEDV，还能有效抑制TGEV和PDCoV的复制，提示RPSA是猪肠道冠状病毒共用的关键宿主因子。

这些结果层层递进，从高通量筛选发现靶点，到细胞和分子水平的功能验证，再到信号通路和代谢层面的机制剖析，最后扩展到相关病毒，形成了一个逻辑严密、证据充分的完整故事链。

四、 结论与价值

本研究得出了几个核心结论：首先，核糖体蛋白SA是猪流行性腹泻病毒复制所必需的关键宿主因子，但其功能并非作为病毒进入的受体，而是作用于病毒进入后的复制阶段。其次，RPSA通过正调控宿主细胞的ERK1/2 MAPK信号通路来促进PEDV复制。第三，RPSA参与调控PEDV感染引发的宿主脂质代谢重编程，影响脂质合成、运输和积累，这也是其支持病毒复制的机制之一。第四，也是最重要的一点，RPSA的作用具有广谱性，它还能通过调控APN表达和ERK1/2通路影响其他猪肠道冠状病毒的感染。

本研究的科学价值在于：1）首次系统性地在猪源细胞中针对膜蛋白进行了CRISPR筛选，为发现猪病毒宿主因子提供了新的方法学范例；2）首次详细阐明了RPSA在冠状病毒复制中的具体作用和分子机制，特别是其通过ERK1/2通路和脂质代谢调控病毒复制的新发现，深化了对病毒-宿主相互作用的理解；3）挑战了关于PEDV受体的传统争议，明确将RPSa定位为“复制因子”而非“进入受体”，为后续研究指明了方向；4）发现了RPSA作为猪肠道冠状病毒共用的宿主依赖因子，为开发针对这类病毒的广谱性抗病毒策略（例如靶向RPSA或其下游通路的小分子药物或基因编辑育种）提供了全新的潜在靶点，具有重要的应用前景。

五、 研究亮点

1. 方法新颖： 自主设计并构建了首个针对猪膜蛋白的规模化CRISPR/Cas9敲除文库，并成功应用于猪源细胞中筛选病毒宿主因子，克服了物种细胞差异可能带来的局限，提高了筛选的针对性和效率。
2. 发现重要： 鉴定出RPSA这一此前在冠状病毒研究中未被充分重视的关键宿主因子，并系统揭示了其非受体功能的新角色。
3. 机制深入： 不仅停留在表型关联，还深入阐明了RPSA通过ERK1/2信号通路和脂质代谢调控病毒复制的双重分子机制，研究层次深入。
4. 视野广谱： 将单一病毒（PEDV）的研究发现，成功拓展到TGEV和PDCoV等其他重要猪肠道冠状病毒，提升了研究的普适性和应用价值，提出了“宿主导向的广谱抗冠状病毒靶点”这一重要概念。
5. 数据翔实： 研究综合利用了CRISPR筛选、分子克隆、细胞生物学、生物化学、转录组学、显微成像等多种技术手段，数据相互印证，结论坚实可靠。

六、 其他有价值内容

本研究在讨论部分还提出了一些有价值的思考和未来方向。例如，作者探讨了RPSA对MAPK通路调控的复杂性（在不同病毒或细胞背景下可能具有相反作用），并推测其可能通过作为层粘连蛋白的受体来间接影响ERK1/2信号。此外，关于RPSA如何调控APN表达的分子机制尚不明确，这为后续研究留下了有趣的空间。论文中构建的猪膜蛋白CRISPR文库本身也是一个宝贵的资源，可供其他研究猪病毒或膜蛋白功能的团队使用。这项研究是一项从技术平台建立到生物学机制发现，再到潜在应用价值展望的综合性优秀工作。