本综述的作者为Jingjie Jiang、Guangyu Yang和Fuqiang Ma，其中Guangyu Yang和Fuqiang Ma为通讯作者，分别来自上海交通大学生命科学技术学院和中国科学院苏州生物医学工程技术研究所。该文发表于 Biotechnology Advances 期刊2023年第66卷，文章编号108173，于2023年5月9日在线发表。本文属于综述论文，主题是荧光激活液滴分选（FADS）中荧光耦合策略（FCSs）在酶、代谢物和抗体超高通量筛选中的研究进展。

本文的核心论点是：荧光耦合策略是FADS技术发展的关键，通过将分析物的浓度、活性、亲和力等性质转化为荧光信号，FADS得以实现每秒高达10^7个反应的筛选通量，比传统微孔板方法提高10^3–10^4倍，试剂成本降低10^6–10^7倍。作者将现有FCSs按照原理划分为四大类：荧光底物策略、酶偶联策略、生物传感器策略和抗体亲和力策略，并对每一类策略的原理、代表性应用、优缺点及未来发展方向进行了系统梳理和批判性比较。

首先，关于荧光底物策略。该策略通过将特定功能基团共价连接到荧光团上以阻断其荧光信号，当目标酶催化释放功能基团后，荧光团产生与酶活性成正比的信号。文中列举了基于香豆素、试卤灵、荧光素、罗丹明等多种荧光团的商业化或定制化荧光底物，用于检测水解酶、氧化还原酶、裂解酶等。该策略的关键技术挑战在于荧光团的液滴保留能力。文中以logD值（在特定pH下化合物在油相与水相中浓度的比值）为评估指标，系统比较了常见荧光团的保留性能，得出logD≈1（pH 7.0）是水-氟化油乳液中荧光团是否适合FADS的临界值：logD>1则荧光团易从液滴中泄漏，logD则保留良好。通过亲水性修饰（如引入磺酸基、羧基等），可以将香豆素类荧光团的保留半衰期从几秒延长至5天以上。该策略的优势是反应组分简单、实验设置容易，但风险在于突变体可能被选择为识别荧光团基团而非天然底物，因此必须控制假阳性突变体。

其次，关于酶偶联策略。由于大多数天然酶或代谢物本身不具荧光，酶偶联策略利用天然氧化酶、还原酶、转移酶等将非荧光代谢物的浓度信息转化为荧光信号。最常用的体系是过氧化物酶偶联体系（如辣根过氧化物酶/Amplex Red/H₂O₂系统）和过氧化物酶-氧化酶偶联体系。例如，利用乙醇氧化酶、葡萄糖氧化酶、丙酮酸氧化酶等特异性氧化酶氧化目标代谢物产生H₂O₂，再通过HRP与荧光底物（如Amplex Red）反应生成荧光信号。文中列举了多种荧光底物替代品，如MNDH和DCFH类似物，以克服Amplex Red在特异性方面的局限性。与荧光底物策略相比，酶偶联策略可直接使用天然底物，避免了因突变体适应荧光团基团而产生的假阳性，且可通过更换偶联酶灵活适应不同分析物。但其挑战在于偶联反应的设计和开发需要针对特定靶酶和底物进行优化。

第三，关于生物传感器策略。该策略利用转录因子、RNA适体、核糖开关或FRET等生物传感元件将分析物识别事件转化为荧光信号。转录因子型生物传感器通过小分子化合物调控下游荧光报告基因的表达，已用于筛选短中链脂肪酸、3-脱氢莽草酸、D-阿洛酮糖等高产菌株。RNA型生物传感器（如核糖开关和Spinach适体）通过构象变化调控翻译或激活荧光配体，用于检测色氨酸、酪氨酸、链霉亲和素等。FRET型生物传感器利用供体和受体荧光团之间的能量转移，已用于筛选具有高保真度的TNA聚合酶等人工遗传聚合物合成酶。生物传感器策略的优势在于可以实现代谢物浓度的动态监测和调控，但受限于具有不同特异性的生物传感器数量，广泛适用性受到制约。

第四，关于抗体亲和力策略。该策略利用抗体、抗原和微珠作为偶联元件，包括荧光定位分析、酶活性阻断分析和亲和响应报告细胞分析三种主要形式。荧光定位分析通过共包封抗体分泌细胞与靶细胞或微珠，使分泌的抗体定位并结合到靶标表面，形成局部荧光峰，用于筛选OKT9杂交瘤细胞或IL-10分泌性T细胞。酶活性阻断分析通过抗体结合并抑制靶酶（如ACE1）的活性中心，降低酶促反应产生的荧光信号，实现了9400倍的富集效率。亲和响应报告细胞分析则利用激动型抗体（如CD40激动剂）或双特异性抗体（如BiTE）激活报告细胞中的NF-κB-GFP信号通路，产生GFP信号。该策略能够实现对单细胞分泌功能的定量、高灵敏度和实时动力学测量，但存在多样性低、通量较低以及潜在筛选偏倚等问题。

文章最后总结了四种FCSs的优缺点，并指出FADS仍面临荧光底物泄漏、偶联反应设计困难、稳定特异适体设计等挑战。作者还简要讨论了其他非荧光液滴分选方法（如吸光度激活液滴分选、电化学液滴分选、拉曼激活液滴分选、质谱液滴分选等）的潜在互补价值，认为这些技术有望拓宽微流控液滴分选的应用范围。本综述的学术价值在于首次系统归纳了FADS中FCSs的最新进展，为研究人员根据不同分析物类型选择合适的荧光耦合策略提供了指南，并为FADS技术的进一步扩展提供了重要参考。