转录因子MdBPC2通过调控生长素生物合成改变苹果生长并促进矮化
本研究报告了一项关于苹果矮化分子机制的重要研究。以下是针对该研究的学术报告。
一、 研究团队与发表信息 本研究由西北农林科技大学园艺学院、旱区作物逆境生物学国家重点实验室/陕西省苹果重点实验室的赵海燕、万淑媛、黄亚妮、李晓强、焦甜甜、张智军、马百全、朱凌骋、马锋旺和李明军（通讯作者）等研究人员共同完成。研究成果以“the transcription factor mdbpc2 alters apple growth and promotes dwarfing by regulating auxin biosynthesis”为题，于2023年11月29日在线发表于植物学领域知名学术期刊 The Plant Cell 上，并于2024年第36卷第3期正式刊出。
二、 研究背景与目的 研究领域属于植物分子生物学与遗传学，聚焦于木本果树（苹果）株型（尤其是矮化）的遗传调控机制。植物株高是影响作物产量的关键农艺性状，传统上主要认为赤霉素（Gibberellic Acid， GA）通路是调控株高的核心途径。然而，近年研究发现其他激素，如生长素（Auxin），在调控植物结构发育中也扮演着重要角色。例如，水稻生长素合成缺陷突变体表现出矮化、叶片形态改变等表型。生长素合成主要依赖于色氨酸（Tryptophan， Trp）依赖途径，其中YUCCA（YUC）家族蛋白是催化限速步骤的关键酶。其表达受到转录因子（Transcription Factor， TF）和表观遗传机制的精密调控。
在植物中，存在一个植物特有的小家族转录因子——基本五半胱氨酸（Basic Pentacysteine， BPC）家族。前期研究表明，拟南芥和水稻中的BPC家族成员参与调控胚胎发育、根生长、开花等多种过程，且BPC基因（尤其是Class I类成员）的突变或过表达会影响植物株高，但其具体分子机制尚不清楚。在苹果中，Class I类的BPC基因（如MdBPC2）在矮化砧木中表达量更高，但其如何调控苹果生长和矮化的机制仍是未知的。
因此，本研究旨在阐明苹果转录因子MdBPC2在调控株型发育中的作用机制。核心科学问题是：MdBPC2如何通过调控下游基因表达和表观遗传修饰来影响生长素生物合成，从而导致苹果植株矮化？研究目标包括：1）验证MdBPC2对苹果生长表型（株高、叶片、根系）的影响；2）探究MdBPC2是否及如何影响内源激素（尤其是生长素）水平；3）鉴定MdBPC2直接调控的下游靶基因；4）揭示MdBPC2抑制靶基因表达的分子机制，特别是是否涉及表观遗传修饰。
三、 详细研究流程 本研究采用了分子生物学、遗传学、生物化学和组学相结合的系统性研究策略，主要流程可分为六个部分。
第一部分：MdBPC2的鉴定与基本特性分析 首先，研究人员利用拟南芥BPC蛋白序列在苹果基因组数据库中进行比对，鉴定出6个苹果BPC家族成员（MdBPC1-6），并根据系统发育树将其分为Class I（MdBPC1， MdBPC2）和Class II（MdBPC3-6）两类。通过qPCR（Quantitative PCR）分析，发现Class I成员（特别是MdBPC2）在5种矮化砧木中的表达量显著高于5种标准砧木。因此，选择MdBPC2作为后续研究对象。 接着，对MdBPC2进行了功能表征：1）组织表达谱分析：qPCR结果显示MdBPC2在根、茎、叶、茎尖和发育果实中广泛表达，在茎尖表达量最高。2）亚细胞定位：构建35S启动子驱动的MdBPC2-GFP融合蛋白载体，通过基因枪法转化洋葱表皮细胞。激光共聚焦显微镜观察显示，GFP荧光信号仅集中在细胞核中，表明MdBPC2是一个核定位蛋白。3）转录活性分析：在酵母双杂交系统中，MdBPC2无自我激活活性。在植物瞬时表达系统中，将MdBPC2与转录激活域VP16融合（VP16-MdBPC2或MdBPC2-VP16）并共转化烟草叶片，通过双荧光素酶报告基因（Luciferase， LUC）检测发现，MdBPC2能显著抑制VP16的转录激活活性，证明MdBPC2具有转录抑制活性。
第二部分：MdBPC2转基因苹果植株的创制与表型分析 为了在整体植株水平研究MdBPC2功能，研究团队构建了MdBPC2过表达（Overexpression， OE）和RNA干扰（RNA interference， RNAi）载体，并通过农杆菌介导法转化苹果品种‘GL3’。通过PCR和RT-qPCR筛选，获得了3个过表达株系（MdBPC2-OE1/3/4）和3个RNAi株系（MdBPC2-RNAi3/5/6）。在过表达株系中，MdBPC2转录本水平约为野生型（Wild Type， WT）的15倍；在RNAi株系中，MdBPC2表达量下降了约60%。RNAi株系中MdBPC1表达也受到抑制，但其他BPC基因表达无显著变化。 随后，对转基因植株进行了详细的表型观测和测量：1）株高与茎结构：与WT相比，过表达植株生长明显受抑制，株高仅为WT的29%，节间缩短，茎秆增粗（增加1.25倍）。茎纵切面显微观察显示细胞长度变小，单位面积细胞数量增加。2）叶片形态：过表达植株叶片长宽比减小，变得更圆。3）根系发育：过表达植株根系发育不良，总根长缩短，侧根数量减少。而MdBPC2沉默植株未表现出明显的表型变化，暗示BPC家族成员间可能存在功能冗余。
第三部分：激素含量测定与表型挽救实验 为了探究矮化表型的激素基础，研究人员测定了转基因植株茎尖中生长素（IAA）、细胞分裂素（Cytokinin， CTK）、赤霉素（GA）和油菜素内酯（Brassinolide， BR）的含量。结果显示，过表达植株中IAA含量显著降低（为WT的48.0%-61.1%），而CTK、GA和BR含量无显著变化。 为验证IAA缺乏是导致表型的原因，进行了表型挽救实验：1）外源IAA处理：用不同浓度（0， 0.1， 0.2， 0.5， 1 mg/L）的IAA喷洒MdBPC2-OE植株。结果表明，外源IAA能以剂量依赖的方式恢复过表达植株的株高、叶片发育和根系生长，而高浓度IAA（1 mg/L）反而会抑制WT生长，说明过表达植株对IAA浓度更敏感。2）抗生长素处理：用不同浓度的抗生长素PCIB（p-chlorophenoxyisobutyric acid）处理WT植株，当浓度达到500 μM时，WT表现出与MdBPC2-OE植株类似的矮化、叶片形态改变和侧根减少表型，进一步证明降低生长素活性足以诱发矮化。 由于MdBPC2单基因沉默未改变IAA水平，研究人员利用病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing， VIGS）技术同时沉默多个BPC基因。结果表明，只有当Class I和Class II的所有6个BPC基因被同时沉默时，植株的IAA含量才显著增加，这证实了苹果BPC家族成员在调控生长素积累方面存在功能冗余。
第四部分：MdBPC2下游靶基因的鉴定与验证 为解析MdBPC2如何降低IAA含量，研究人员对WT和三个MdBPC2-OE株系的茎尖进行了RNA测序（RNA-seq）。分析发现，与WT相比，三个过表达株系共同存在1020个差异表达基因（433个上调，587个下调）。将此基因集与已知的苹果生长素合成与代谢基因进行比较，发现了3个重叠基因：两个生长素合成关键酶基因 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b ，以及一个参与生长素稳态反馈调节的基因 Mdgh3.1a 。RNA-seq和qPCR验证均显示，这三个基因在过表达株系中表达下调。 为了在全基因组范围内鉴定MdBPC2的直接结合位点，研究采用了DNA亲和纯化测序（DNA affinity purification sequencing， DAP-seq）。这是一种不依赖于抗体的高通量筛选转录因子结合位点的方法。将体外表达的His标签MdBPC2蛋白与苹果‘GL3’幼苗的基因组DNA文库共孵育，纯化结合DNA并进行高通量测序。MEME套件分析揭示了MdBPC2结合区域的核心序列为富含GAGA的基序“gagagagagagagag”。电泳迁移率变动分析（Electrophoretic mobility shift assay， EMSA）证实，纯化的MdBPC2-GST融合蛋白能特异性结合带有生物素标记的GAGA-rich探针，且该结合可被未标记的竞争性探针所抑制。 进一步分析DAP-seq数据中 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 基因座上的结合峰，发现其启动子区域存在显著的MdBPC2结合峰，而 Mdgh3.1a 则没有。这提示MdBPC2可能通过直接抑制 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 的转录来抑制生长素合成。
第五部分：MdBPC2直接抑制 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 转录的机制验证 通过一系列实验证实了MdBPC2对这两个靶基因的直接抑制：1）瞬时表达报告基因检测：在苹果愈伤组织中，共转化MdBPC2过表达载体和由 Mdyuc2a 或 Mdyuc6b 启动子驱动的LUC报告基因。结果显示，MdBPC2的过表达显著降低了报告基因的活性。2）酵母单杂交（Yeast one-hybrid， Y1H）：将 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 启动子中不同片段（含或不含GAGA-rich元件）作为“诱饵”，与MdBPC2激活域（Activation Domain， AD）融合蛋白共转化酵母。结果表明，只有启动子片段包含GAGA-rich元件时，酵母才能在选择性培养基上生长，证明MdBPC2通过GAGA-rich元件结合到这些启动子上。3）染色质免疫沉淀-qPCR（Chromatin immunoprecipitation-qPCR， ChIP-qPCR）：在表达MdBPC2-GFP的转基因苹果愈伤组织中，使用GFP抗体进行ChIP。qPCR检测显示，针对 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 启动子中GAGA-rich区域的片段在MdBPC2-GFP样品中被显著富集，而不含此元件的对照区域则未被富集。 这些结果综合证明，MdBPC2能直接结合到 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 启动子的GAGA-rich元件上，并抑制其转录。
第六部分：表观遗传机制探索——MdBPC2与多梳蛋白（Polycomb Group， PcG）复合体互作 由于组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）是一种重要的转录抑制性表观遗传标记，研究人员检测了MdBPC2-OE植株中 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 基因座上的H3K27me3水平。ChIP-qPCR分析显示，与WT相比，过表达植株中这两个基因位点（尤其是翻译起始密码子附近）的H3K27me3修饰水平显著升高。 在植物中，H3K27me3主要由PcG蛋白复合体催化并维持。为了探究MdBPC2是否与PcG复合体互作，研究人员进行了酵母双杂交（Yeast two-hybrid， Y2H）筛选，发现MdBPC2与PcG相关蛋白MdLHP1a和MdLHP1b（Like Heterochromatin Protein 1）存在互作。这一互作关系随后通过以下实验得到验证：1）双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation， BiFC）：在烟草表皮细胞中共表达nYFP-LHP1a/b和cYFP-BPC2，可以在细胞核中观察到YFP荧光信号重建。2）荧光素酶互补成像（Luciferase complementation imaging， LCI）：在烟草叶片中共表达cLUC-BPC2和nLUC-LHP1a/b，检测到强烈的化学发光信号。3）Pull-down实验：体外表达的GST-LHP1a/b蛋白能与His-MdBPC2蛋白结合。 为了验证MdLHP1在MdBPC2抑制通路中的作用：1）ChIP-qPCR：在过表达MdLHP1-FLAG的WT和转基因植株中，用FLAG抗体进行ChIP。结果显示，在MdBPC2-OE背景下，MdLHP1在 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 启动子上的富集程度显著高于WT和RNAi植株。2）基因功能回复：在MdBPC2-OE植株中利用VIGS技术沉默 MdLHP1 ，发现 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 位点的H3K27me3水平降至与WT相当。3）启动子突变分析：构建了含突变GAGA-rich元件的 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 启动子驱动的LUC报告基因，转化苹果愈伤组织。ChIP-qPCR显示，与含完整GAGA元件的转基因株系相比，突变株系在LUC基因位点的H3K27me3水平显著降低，且LUC表达量升高。这证明MdBPC2的结合位点是MdLHP1介导的H3K27me3修饰所必需的。 最后，在过表达MdBPC2-GFP的苹果愈伤组织中（MdBPC2-GFP-OE）， Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 表达下调，利用合成生长素响应元件DR5驱动的GUS报告基因检测显示内源生长素信号减弱。而当在此背景下沉默 MdLHP1 后，GUS活性得到恢复甚至超过WT水平，进一步证实了MdLHP1参与了MdBPC2对生长素生物合成的调控。
四、 主要研究结果 本研究取得了一系列环环相扣的结果，逐步揭示了MdBPC2的矮化机制： 1. 表型与激素关联：MdBPC2过表达导致苹果植株矮化、节间缩短、叶片变圆、根系发育不良。这一表型与植株茎尖IAA含量显著降低直接相关。外源IAA处理可挽救表型，而用抗生长素处理WT可模拟表型，确立了“MdBPC2过表达 → IAA降低 → 矮化表型”的因果关系。 2. 靶基因鉴定：RNA-seq和DAP-seq联合分析，结合EMSA、Y1H、ChIP-qPCR和瞬时表达报告基因实验，明确鉴定出生长素合成关键基因 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 是MdBPC2的直接转录抑制靶标。MdBPC2通过结合其启动子区的GAGA-rich元件发挥抑制作用。 3. 表观遗传机制解析：发现了MdBPC2抑制靶基因表达的新机制。MdBPC2自身不具备组蛋白修饰酶活性，但它通过物理互作招募PcG蛋白复合体的组分MdLHP1到 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 的染色质区域。这种招募依赖于MdBPC2与GAGA-rich元件的结合。MdLHP1的招募促进了该位点H3K27me3抑制性标记的沉积和维持，导致染色质凝缩，从而更有效地抑制基因转录。在MdBPC2-OE植株中，这一过程被放大，导致靶基因被强烈抑制，IAA合成严重受阻。 4. 功能冗余性：单个MdBPC2基因的沉默未引起明显表型和IAA变化，但通过VIGS同时沉默所有Class I和Class II的BPC基因则显著提高了IAA水平，说明了苹果BPC家族在调控生长素稳态上存在功能冗余，这与拟南芥中的研究发现一致。
五、 研究结论与意义 本研究得出核心结论：苹果转录因子MdBPC2通过招募PcG蛋白MdLHP1到生长素生物合成基因 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b 的启动子区域，催化并维持H3K27me3抑制性组蛋白修饰，从而抑制这两个关键基因的转录，最终降低植株内源生长素水平，导致植株矮化、叶片形态改变和根系发育抑制。 其科学价值主要体现在：1）机制创新：首次在多年生木本植物中揭示了BPC转录因子通过“转录因子-表观阅读器（MdBPC2-MdLHP1）-组蛋白修饰（H3K27me3）”的级联通路来精细调控激素合成基因，进而控制株型发育的完整分子机制。这为理解植物，特别是果树，如何通过整合转录调控和表观遗传调控来塑造复杂农艺性状提供了新范式。2）理论拓展：将BPC蛋白调控植物发育的机制从拟南芥、水稻等草本植物拓展到了苹果这类重要的经济林木，证实了该调控通路的保守性与特殊性。同时，深化了对生长素合成转录调控网络的认识。3）应用潜力：MdBPC2作为一个负调控生长素合成的关键因子，为苹果乃至其他果树的矮化砧木和品种的分子设计育种提供了重要的候选基因和理论依据。通过调控MdBPC2或其下游通路，有望实现对果树株型的精准遗传改良。
六、 研究亮点 1. 系统性与完整性：研究从基因克隆、表型分析、激素测定、靶基因筛选、互作蛋白鉴定到表观机制解析，形成了一个逻辑严密、证据链完整的系统性研究。 2. 技术创新与应用：娴熟运用了包括DAP-seq（用于无偏好性鉴定TF结合位点）、VIGS（用于木本植物多基因同时沉默）、多种体内外互作验证技术（Y2H， BiFC， LCI， Pull-down）以及ChIP-qPCR等前沿技术，特别是将DAP-seq成功应用于苹果研究，高效地解决了传统ChIP-seq在木本植物中可能面临的抗体限制等问题。 3. 机制深度：不仅发现了MdBPC2直接抑制靶基因，更进一步揭示了其通过招募PcG复合体组分MdLHP1介导H3K27me3修饰来实现长效转录抑制的表观遗传机制，将研究深度从转录调控层面推进到了染色质修饰层面。 4. 模型构建：基于所有实验结果，提出了一个清晰的工作模型（如图9所示），形象地阐述了在正常和过表达情况下，MdBPC2-MdLHP1模块如何差异性地调控染色质状态和基因表达，最终影响生长素合成和植株结构的动态平衡。
七、 其他有价值的内容 研究在讨论部分指出，除了 Mdyuc2a 和 Mdyuc6b ，RNA-seq数据中生长素稳态相关基因 Mdgh3.1a 的表达也在MdBPC2-OE植株中下调。这暗示MdBPC2的功能可能不仅限于抑制生长素合成，还可能涉及对生长素反馈调节和细胞内稳态的调控，这为后续研究指明了新方向。作者表示，下一步将聚焦于MdBPC2参与维持生长素稳态的机制，这将有助于更深入理解植物如何响应环境变化来调控自身发育。