类型a

作者与发表信息

本研究由来自德国斯图加特大学生化工程研究所（Institute of Biochemical Engineering, University of Stuttgart）的Christopher Sarkizi Shams Hajian、Ralf Takors，以及荷兰帝斯曼生物技术中心（DSM Biotechnology Center）和代尔夫特理工大学（Delft University of Technology）的Cees Haringa、Henk Noorman共同完成。该研究成果于2020年11月27日发表在学术期刊《Processes》上，论文标题为《Predicting by-product gradients of baker’s yeast production at industrial scale: a practical simulation approach》。

研究背景与目标

在生物产品的商业化进程中，将生物过程从小型实验室规模放大到工业规模是最具挑战性的环节之一。在实验室规模下，生物反应器（bioreactor）内能够较为容易地实现理想的均匀混合条件，但在工业规模的大型罐体中，由于经济与物理因素的限制，会不可避免地形成各种梯度，例如限制性底物浓度、副产物、酸碱度（pH）、温度以及剪切率（shear rate）的梯度。微生物在这种动态变化的微环境中循环，会对其生理状态和生产性能产生显著影响，常常导致目标产品的效价（titer）、生成速率（rate）和得率（yield）等关键指标的下降。然而，在实际工业规模下进行验证实验通常伴随着巨大的风险和成本，因此，开发能够有效预测大规模反应器内梯度情况的模拟方法显得尤为重要。

本研究以工业中广泛应用的模式生物——面包酵母（Saccharomyces cerevisiae，一种具有克勒勃特里效应（Crabtree effect，即Crabtree positive）的菌株）为研究对象。该酵母在好氧条件下即便氧气充足，也会在高糖环境中进行溢流代谢（overflow metabolism）产生乙醇；而在厌氧条件下则会消耗乙醇。本研究的主要目标是开发一种实用的模拟方法，将计算流体力学（CFD）与机制性黑箱动力学模型（mechanistic black-box model）相结合，预测工业规模22立方米发酵罐中面包酵母生产过程中的副产物浓度梯度。具体关注氧气（O2）、葡萄糖、乙醇和二氧化碳（CO2）的浓度异质性，评估不同生物量浓度下的副产物生成机制，并为理性设计规模缩小（scale-down）实验提供依据。

详细研究工作流程

本研究的工作流程主要分为三大步骤：几何建模与计算流体力学设置、生物动力学模型嵌入以及针对两种工业场景的模拟与分析。

第一步：反应器几何建模与流场模拟。 研究团队基于文献公开的示意图和尺寸，在ANSYS® Academic Research Workbench软件中建立了22立方米斯塔万格型（Stavanger）工业发酵罐的几何模型。针对计算流体力学模拟，他们生成了一个包含约250万个六面体单元的网格，并对叶轮高度处的湍流动能（turbulent kinetic energy, k）、湍流动能耗散率（dissipation of turbulent kinetic energy, ε）和速度剖面进行了验证，以确保网格的精确性。 模拟设置采用了欧拉-欧拉（Eulerian model）双相流模型来模拟气液两相，使用可实现的k-ε模型对湍流进行建模，物理属性上液相近似为水，气相则假设为理想气体，气泡平均直径设为0.009米。叶轮的旋转通过多重参考系法（Multiple Reference Frames, MRF）进行建模。求解策略上，采用Phase Coupled SIMPLE算法处理压力-速度耦合，在初期迭代后，将对流项的离散格式提升为QUICK格式，非稳态离散采用有界二阶隐式格式。 模型通过两个关键实验参数进行验证：一是混合时间（mixing time, τ95），通过模拟在顶层叶轮上方投入葡萄糖虚拟脉冲并监测探头处的浓度变化获得，模拟结果为186秒，与先前研究相符；二是基于模拟的19%气含率（gas holdup）与体积传质系数（kla）190 h⁻¹，这两者均与实验测量值和历史数值研究吻合，从而确保了流场的可靠性，为后续的生物动力学模拟打下了坚实基础。

第二步：生物动力学模型集成。 研究团队采用了经典的Sonnleitner和Käppeli黑箱模型来描述酿酒酵母的底物吸收、生长和副产物生成。该模型以酵母的有氧呼吸能力上限为代谢瓶颈，其核心逻辑如下：当生物质特定的葡萄糖吸收速率（qs）超过其进行有氧氧化的相关需氧量阈值时，溢流代谢启动，多余的碳流转向还原性途径，导致乙醇的分泌。同时，该模型也允许在有氧且葡萄糖受限的条件下，进行乙醇的消耗。 模型的具体运算基于莫诺方程（Monod kinetics）来计算底物的吸收速率，并通过一套系统的化学计量学方程和元素守恒定律，计算不同代谢途径下的生物质、氧气、二氧化碳和乙醇的生成或消耗速率。同时，模拟还考虑了氧气、二氧化碳和乙醇在两相间的传质过程，其中气相被视为混合良好的零阻力相，使用了亨利定律来计算液相界面的平衡浓度，并采用了表面更新方法（surface renewal approach）来建模液相传质系数。这一机制性模型的嵌入，使得计算流体力学模拟不仅能计算物理场，更能反映微生物的真实代谢行为。

第三步：工业场景模拟设置。 研究共设置了两种模拟场景，依次进行。场景一模拟实验规模的发酵条件，生物质浓度设为10克/升。这一场景的目的是复现此前文献中的实验条件，以校验整套耦合模型的适用性和预测准确性。场景二则引入了一个更具工业相关性的背景，即模仿蛋白质生产条件，将生物质浓度提升至25克/升，而其他如通气量、搅拌转速等操作条件则保持不变。通过对比这两种场景，研究者旨在探究不同生物量负荷下，罐内副产物梯度的变化规律及其形成机制的差异。

主要研究结果与逻辑关系

模拟结果首先在场景一中得到了详细的呈现与验证。 关于溶解氧（dissolved O2, dO2）浓度，模拟显示罐底区域由于静水压力较高、代谢活动较弱和气相氧气分压较高，溶解氧浓度最高；而在靠近顶部进料点的区域则出现最低溶解氧浓度，约3.7 × 10⁻⁵ 摩尔/升（约1.2 ppm）。这一最低值仍比文献报道的酿酒酵母溶解氧临界值（~4.6 × 10⁻⁶ 摩尔/升）高出一个数量级，且极低氧区域所占体积比例可忽略不计。这一结果有力地证实了在该操作条件下，“无氧限制”的假设是成立的，为将葡萄糖溢流代谢与氧限制效应区分开来提供了直接证据。 关于溶解二氧化碳（dissolved CO2, dCO2）浓度，模拟结果表明，其梯度变化极小，仅围绕平均值上下浮动不超过±5%。由于操作pH值为5，无机碳主要以溶解的二氧化碳形式存在。研究发现，液相中溶解二氧化碳接近饱和状态，这表明在工业规模发酵中，细胞会长时间暴露于高浓度的溶解二氧化碳环境中。 关于乙醇浓度，其梯度分布比溶解二氧化碳更显著，但不及溶解氧。乙醇浓度最高的区域在进料点附近，反映了此处细胞因高糖引发的溢流代谢最为旺盛；而浓度最低值则出现在罐底。最重要的是，模拟揭示了乙醇在整个发酵罐中广泛分布，超过97%的罐体积内均存在可被利用的乙醇，这支持了“由于溢流产物乙醇的再消耗，罐内不存在真正的葡萄糖饥饿区”这一假设。

接下来，场景二（25克/升生物量）的结果揭示了生物量增加所引发的显著变化。溶解氧梯度变得异常陡峭，出现了明显的氧限制区域，其中约有0.04立方米体积内的溶解氧浓度低于临界值，导致约10%的乙醇生成源于溶解氧限制（巴斯德效应，Pasteur effect），而非单纯的溢流代谢。相应地，乙醇梯度也呈现双重变化：一是在进料点周围因局部氧限制加剧而产量更高；二是因整体生物量增加，罐内乙醇的体积消耗速率提升，导致罐底区域的乙醇浓度相比于场景一更低。然而即便如此，模拟仍显示超过90%的罐体积内存在足以被立即利用的乙醇浓度。葡萄糖梯度的模拟结果与实验数据比较趋势一致，但在罐底区域，模拟值低于实验测量值，揭示出下一代代谢模型需考虑细胞内缓冲物质（如海藻糖）作为额外碳源的可能性。

研究结论与意义

本研究得出结论：在大规模面包酵母生产中，进料点附近必然会通过溢流代谢产生乙醇，这会降低该区域的细胞生长速率。该方法能够有效区分由溢流代谢（克勒勃特里效应）和溶解氧限制（巴斯德效应）分别造成的乙醇生成，这对于过程优化至关重要。研究还指出，与葡萄糖、氧气和乙醇的剧烈波动不同，溶解二氧化碳的胁迫是长期且持续的，因此在规模缩小实验中应采用不同的模拟策略。此外，乙醇在罐内作为副产物被广泛再消耗的现象，暗示饥饿区可能不存在，这为规模缩小实验设计提供了新的考量因素。该研究的科学价值在于证实了将中等复杂度的机制性模型与计算流体力学耦合，能够以合理的计算代价深刻洞察工业规模生物过程中的梯度形成机理，其应用价值在于可直接指导通过改变菌株、反应器设计或操作条件来解决问题，并为设计具有代表性的规模缩小反应器提供关键信息。

研究亮点

本研究的突出亮点在于实现了对工业规模发酵罐中乙醇生成与再消耗过程的首次计算流体力学模拟，打破了传统模拟仅关注底物的局限。其方法上的新颖性体现在，通过一个实用的机制性黑箱模型与计算流体力学的高效耦合，成功地区分了溢流代谢与氧限制对副产物形成的贡献，为工业放大中的问题诊断提供了更为精细的数字化工具。此外，研究对溶解二氧化碳长期胁迫特性的揭示，以及对“乙醇补偿”抑制饥饿区这一现象的定量化展示，都是非常有价值的发现。