本研究由José Hanquier、Yannick Sorlet、Dominique Desplancq、Laurence Baroche、Marc Ebtinger、Jean-François Lefèvre、Franc Pattus、Charles L. Hershberger和Alain A. Vertès等人完成，主要作者分别隶属于Eli Lilly & Co.旗下的Lilly Research Laboratories、gib-esbs以及Lilly France。该研究于2003年2月发表在Applied and Environmental Microbiology第69卷第2期上，页码为1108至1113。

本研究的学术背景属于微生物学与蛋白质工程交叉领域，核心目标是利用甲基营养型酵母Pichia pastoris（巴斯德毕赤酵母）异源表达牛胰蛋白酶原（bovine trypsinogen），并进一步实现重组牛胰蛋白酶（trypsin）的生产。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶（serine protease），在哺乳动物消化系统中参与胰腺酶级联激活过程。其前体胰蛋白酶原由胰腺分泌，进入十二指肠后被肠激酶（enterokinase）识别并切割前肽（propeptide）中(asp)4-lys序列，释放出活性胰蛋白酶。胰蛋白酶能水解赖氨酸和精氨酸残基羧基端的肽键，并且能够自激活其自身酶原，这种自激活特性在体内形成放大级联反应。牛胰蛋白酶在哺乳动物细胞培养和制药工业中应用广泛，传统生产方法依赖于从牛胰腺中提取。然而，疯牛病等牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathies）的暴发使得动物来源产品在制药工业中的应用受到严格限制，因此开发通过微生物发酵生产重组牛胰蛋白酶的方法变得十分重要。此前研究曾尝试在大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表达胰蛋白酶原，但存在产量低、包涵体形成或溶解度差等问题。Pichia pastoris是一种甲基营养型酵母，具备完整的真核分泌机制，能够分泌含有多个二硫键的蛋白质，并且可实现高密度培养和工业化放大。研究的主要假设是：只要阻断酶原在宿主细胞内的自激活，就可以避免表达毒性蛋白对宿主细胞的伤害，并且在体外通过特定酶切割使其活化为成熟胰蛋白酶。

研究的详细流程包括若干关键实验步骤。第一步是构建牛胰蛋白酶原表达载体。野生型牛胰蛋白酶原基因序列来源于Swissprot数据库编号Q29463，使用质粒pPIC9作为基础表达载体，该质粒含有甲醇诱导型AOX1启动子和α-交配因子（α-mating factor）信号序列。研究者将α-交配因子信号序列通过寡核苷酸盒插入到胰蛋白酶原基因的上游，构建了含有天然前肽序列的对照质粒和含有突变前肽序列的质粒。第二步是对胰蛋白酶原前肽序列进行定点突变。野生型前肽第6位为赖氨酸（lysine），该残基是肠激酶和胰蛋白酶的切割识别位点。研究者将第6位赖氨酸替换为天冬氨酸（aspartic acid），使野生型序列VD4K变为VD5，从而破坏了体内激活位点。该突变不影响成熟胰蛋白酶的氨基酸序列，仅改变前肽部分的序列。第三步是将构建的表达载体转化入Pichia pastoris GS115菌株及其蛋白酶缺陷型突变株SMD1163中。表达载体经BglII线性化后通过电穿孔转化整合至AOX1位点，通过组氨酸营养缺陷筛选阳性转化子，并通过定量PCR确认胰蛋白酶原基因在染色体上不超过一个拷贝。第四步是摇瓶发酵实验。对于AOX1启动子控制的重组菌株，细胞先在含甘油的BMGY培养基中生长，再转移至含甲醇的BMMY培养基中诱导表达48小时。对于GAPDH启动子控制的重组菌株，先以葡萄糖培养积累生物量，再转移至以甘油为唯一碳源的培养基中诱导表达。实验比较了45个pPIC9来源克隆和15个pLGD43来源克隆的表达水平。第五步是6升台式发酵罐中试规模发酵。采用三阶段发酵策略，包括初始葡萄糖批量培养阶段、高甘油流加生物量积累阶段和低甘油流加生产阶段。第六步是重组VD5-胰蛋白酶原的定量分析。采用SP Toyopearl 550C阳离子交换树脂批量吸附培养上清液中的VD5-胰蛋白酶原，洗脱后用二肽基氨肽酶（dipeptidyl-aminopeptidase，缩写为ddap）激活，再用TAME底物测定胰蛋白酶活性。第七步是重组胰蛋白酶原的制备性纯化和激活。通过70%饱和硫酸铵沉淀浓缩、CM-Sepharose CL6B阳离子交换层析纯化VD5-胰蛋白酶原，然后在酸性条件下用ddap消化去除前肽val-asp5，得到活性胰蛋白酶，最后通过benzamidine-Sepharose CL6B亲和层析纯化成熟胰蛋白酶。第八步是重组胰蛋白酶的表征，包括N端氨基酸测序、PNGase F去糖基化处理和SDS-PAGE及Western blotting分析。

研究的主要结果如下：首先，表达野生型牛胰蛋白酶原的Pichia pastoris培养上清中几乎检测不到胰蛋白酶原，而检测到低水平的胰蛋白酶活性以及大量非特征性蛋白，表明野生型胰蛋白酶原在细胞内自发激活形成了胰蛋白酶并导致细胞损伤和胞内蛋白泄漏。相比之下，携带突变前肽VD5的胰蛋白酶原成功在培养上清中积累，Western blotting检测到28 kDa和24 kDa两条带。摇瓶产量达到5至10 mg/L，细胞湿重达10 g/100 mL。在6升发酵罐中，GAPDH启动子控制的VD5-胰蛋白酶原产量达到约40 mg/L（实际结果部分报告为33 mg/L，摘要中为40 mg/L，细胞密度为60 g干重/L）。28 kDa和24 kDa两种形式的差异在于N-糖基化程度不同。PNGase F处理后28 kDa条带迁移至与24 kDa条带相同位置，证明28 kDa形式含有N-连接高甘露糖型糖链，而24 kDa形式未被糖基化。两种形式的N端氨基酸序列均与天然牛胰蛋白酶原的成熟蛋白N端一致，说明α-交配因子信号序列和人血清白蛋白信号序列均被正确切割。在体外激活方面，加入ddap前未检测到胰蛋白酶活性，而在0.4 U ddap/mg VD5-胰蛋白酶原条件下24小时后活性胰蛋白酶产率接近100%，并且重组胰蛋白酶的比活性与天然胰蛋白酶相比无显著差异。ddap激活后的胰蛋白酶在25°C条件下保持稳定至少24小时。

本研究的结论是：通过在酶原前肽激活位点引入单一位点突变阻止其在Pichia pastoris体内的自激活，可以在该酵母中高效积累重组牛胰蛋白酶原，并通过体外ddap消化前肽实现完全活化为成熟胰蛋白酶。该策略为有害蛋白如蛋白酶类的高效异源表达提供了新思路。研究还证明了Pichia pastoris作为替代大肠杆菌的微生物宿主具有重要价值，尤其是在大肠杆菌中形成包涵体的蛋白。此外，重组胰蛋白酶完全不含污染的胰腺酶如牛糜蛋白酶（bovine chymotrypsin），因此可作为理想参考材料。

本研究的亮点包括：第一，提出并验证了“失活酶原策略”，即通过阻断酶原的体内激活途径来生产对宿主细胞有害的蛋白酶，再通过体外适宜外肽酶完成成熟过程，这在此前尚无报道。第二，通过单一位点突变lys到asp取消了前肽的体内切割位点而不改变成熟蛋白的序列与功能。第三，利用GAPDH启动子在无甲醇条件下实现了中等规模的高密度发酵生产。第四，发现重组胰蛋白酶存在不同的N-糖基化形式，但糖基化对酶活性无明显不利影响。第五，生产过程中胰蛋白酶原保持无活性状态，避免了细胞毒性，并且在酸性pH下进行激活可防止胰蛋白酶自溶性降解，从而获得高活性的单链β-胰蛋白酶。最后，该研究为制药工业提供了不依赖动物来源原料的重组胰蛋白酶生产新方法，具有重要的安全应用前景。